Autologní adoptivní přenos T regulačních buněk u autoimunitních onemocnění.

Autoimunitní poruchy jsou chronická onemocnění způsobená poruchou tolerance vůči vlastním antigenům

; jedna hypotéza zahrnuje selhání centrální a periferní tolerance, přičemž ta druhá je spojena se sníženým počtem Treg (CD4+CD25+FpxP3CD127-T-regulačních) buněk nebo selháním jejich funkce (6).

V preklinických studiích bylo prokázáno, že lidské CD4+CD25+CD127- Treg buňky jsou účinné v prevenci reakce štěpu proti hostiteli (GvHD) (7, 23), autoimunitních onemocnění (13, 22) a oddálení odmítnutí štěpu (19, 26 ).

Pozitivní výsledky daly důvod k použití Treg buněk pro léčbu lidských onemocnění a výsledky prvních klinických studií s adoptivně přenesenými výzkumnými pracovníky Treg buněk publikovaných v roce 2009 (24).

Co tato studie přináší? Toto je první intervenční studie o adoptivním přenosu Treg buněk v Egyptě jako terapeutická studie pro pacienty s refrakterními autoimunitními onemocněními, kteří nereagují na základní léčbu dostupnou v ústavu. Separace těchto buněk Treg byla provedena u egyptských pacientů, ale pouze jako popisná studie (jak je uvedeno níže).

vyšetřovatelé si vyberou dvě nemoci, aby dali nějakou šanci na úspěch pro získání finančních prostředků na náš výzkum, protože jeho cena je drahá. Vyšetřovatelé zvolili tato dvě onemocnění (refrakterní lupus nefritida a diabetes 1. typu u dospělých, protože jde o nejběžnější studie v mezinárodní publikaci).

vyšetřovatelé vyhodnotí bezpečnost a účinnost autologního adoptivního přenosu Treg (CD4CD25FoxP3 CD127 s nízkou regulací) buněk pacientům s refrakterními autoimunitními onemocněními: refrakterní lupus nefritida a dospělí diabetes mellitus 1. typu.

2. STUDIJNÍ OTÁZKA/CÍL / CÍLE vyšetřovatelé zhodnotí bezpečnost a účinnost autologního adoptivního přenosu Treg (CD4CD25FoxP3 CD127low regulačních) buněk pacientům se SLE s refrakterní lupusovou nefritidou a pacientům s diabetem mellitus 1. typu u dospělých.

Plán monitorování AE je zdokumentován v protokolu o kontrole systémových a lokálních nežádoucích příhod pomocí CTCAE(5). Hodnocení bezpečnosti se bude skládat z nepřetržitého monitorování a hlášení nežádoucích příhod (AE) (s měsíčními návštěvami nebo podle klinické indikace mobilním kontaktem nebo mimo něj návštěvy pacientů); monitorování vitálních funkcí, fyzikální vyšetření a laboratorní vyšetření. Pro každou AE, která se může vyskytnout, bude provedena přesná dokumentace a náležitá péče (v ambulantních a lůžkových jednotkách, jak je indikováno). Pacienti budou sledováni měsíčně za účelem zjištění jakýchkoli nežádoucích příhod nebo podle klinického hodnocení společností Mobil contact. Bude posouzeno následující:

1. Počet bílých krvinek (WBC) s diferenciálním počtem, počet červených krvinek (RBC), počet krevních destiček (PLT), hemoglobin (Hb) a hematokrit (Hct).

2. Testy jaterních funkcí, ledvin a měření elektrolytů.

   Účinnost adoptivního přenosu buněk Treg:

   • Klinické hodnocení: Odebírání kompletní anamnézy a důkladné klinické vyšetření s hodnocením skóre aktivity onemocnění (klinicky a laboratorně) pro porovnání s výchozími údaji.

   • Laboratorní vyšetření podle typu autoimunitního onemocnění:

     1. Laboratorní testy pro detekci exacerbace onemocnění,
     2. CD4CD25FoxP3,CD127nízký počet buněk ve vzorku periferní krve,
     3. Detekce sérových cytokinů (INF-gama,TNF-alfa,IL1,IL2,TGF-beta,IL-10,IL-17)

   • V případě potřeby radiologické vyšetření podle typu autoimunitního onemocnění:

     1. Ultrazvuk
     2. CT vyšetření
   • Vědci zjistí účinnost infuze T reg buněk po 3 měsících, po 6 měsících a po jednom roce podávání.
3. METODOLOGIE:

Typ studie: Nerandomizovaná pilotní studie otevřené fáze 1 Nastavení studie: Tabulka odpovědností (Tabulka 1): viz níže Délka studie: Dva roky.

Studijní populace:

• Deset pacientů se systémovým lupus erythematodes (SLE) s refrakterní lupus nefritidou: kritéria pro zařazení a vyloučení
• Deset pacientů s diabetem 1. typu: kritéria pro zařazení a vyloučení

Metoda odběru vzorků:

Účelové vzorky podle předem stanovených kritérií pro zařazení a vyloučení.

Velikost vzorku:

Výzkumníci zahrnou do pilotní studie deset pacientů s každým autoimunitním onemocněním.

Studijní postupy:

• První návštěva: Revmatologický tým a Endokrinologický tým vyberou pacienty podle výše uvedených kritérií z interního oddělení nemocnic ASU. Kompletní laboratorní a imunologická vyšetření budou provedena v centrálních laboratořích nemocnice ASU. Sestry na klinice pro pacienty v nemocnicích ASU odeberou vzorky krve ze všech případů. Pacienti provedou všechny požadované zobrazovací modality na oddělení radiodiagnostiky v nemocnici ASU. Revmatologický tým a endokrinologický tým obdrží písemný souhlas od všech pacientů zařazených do studie.
• Druhá návštěva: Po první návštěvě do jednoho týdne. Pacient se dostaví na interní oddělení. Všichni pacienti budou vyšetřeni klinicky, laboratorně a radiologicky, jak je indikováno pro detekci závažnosti nebo aktivity onemocnění. Pacient půjde do Lékařského výzkumného centra pro odběr vzorků periferní krve za sterilních podmínek pro separaci Treg buněk. Vzdálenost mezi výzkumným centrem a lékařskými odděleními je cca 200 m. Nemocniční převážecí vůz převeze pacienta (golfový vůz) na 150 m po 50 m chůze.
• Třetí návštěva: (po druhé návštěvě do šesti týdnů): pacient se dostaví do lékařského výzkumného centra pro přijetí pod dohledem alergologického a imunologického týmu k podání infuze T reg buněk. Alergologický a imunologický tým bude pacienta sledovat 24 hodin po infuzi.
• Detekce nežádoucích účinků bude kontrolována měsíčně. Mezi pacientem a oběma revmatologickými, endokrinologickými a klinickými imunologickými týmy bude udržován mobilní kontakt pro zaznamenávání jakýchkoli nežádoucích příhod.
• Čtvrtá návštěva: (po třech měsících třetí návštěvy): Lékařský tým provede kompletní laboratorní, imunologické a radiologické sledování v centrální laboratoři ASU a radiologickém oddělení ASU po třech měsících infuze T reg. Bude zaznamenáno klinické hodnocení a detekce aktivity a závažnosti onemocnění.
• Pátá návštěva po šesti měsících infuze. Bude se postupovat stejně jako při návštěvě 4.
• Poslední návštěva po jednom roce pro zjištění jakékoli nežádoucí příhody.
• Etická komise bude informována úplnou zprávou obsahující všechna klinická a laboratorní data o posledních šesti krocích u každého pacienta, kterému byla podána infuze buněk t reg, jak byly zaznamenány imunologickými revmatologickými a endokrinologickými týmy. Obrázek 2 ukazuje schéma postupů a sledování.

Všichni pacienti budou podrobeni následujícímu:

Při první návštěvě

• Odběr kompletní anamnézy a klinické vyšetření včetně hodnocení závažnosti a klinické aktivity onemocnění podle typu autoimunitního onemocnění.
• Vyšetření před léčbou CBC s diferenciálním počtem WBCS, celkovým počtem lymfocytů, počtem červených krvinek (RBC), počtem krevních destiček (PLT), hemoglobinem (Hb) a hematokritem (Hct)
• jaterní funkce, funkční testy ledvin a vyhodnocení elektrolytů (Na, K a Ca).
• Jaterní funkční testy: sérový albumin ,PT a INR .bilirubin celkové a přímé .AST ,ALT, Alkalická fosfatáza ,Sérový albumin.
• Funkční testy ledvin (sérový kreatinin, BUN) a elektrolyty (sérový Na,K a,Ca)
• ESR a CRP.
• Vyhodnocení počtu buněk CD4+CD25+FoxP3+CD127- před intervencí, po třech měsících a po 6 měsících od intervence průtokovou cytometrií.
• Sérologické testy pro všechny pacienty: INF-gama, TNF-alfa, IL-17, IL-2, IL-10 a TGF-beta. Všechny cytokiny budou provedeny testem ELISA před adoptivní transfuzí T reg, po 3 měsících a po 6 měsících transfuze.
• Radiologická vyšetření podle typu autoimunitního onemocnění a pokud je indikováno.
• Laboratorní vyšetření podle autoimunitního onemocnění:

Pacienti se SLE:

• Hladina glukózy v krvi a 2 hodiny po jídle, kompletní krevní obraz (CBC), kompletní analýza moči,
• Měření bílkovin ve 24h moči (g/24h).
• Titr a vzor antinukleárních protilátek (ANA) a protilátky proti dvouvláknové DNA (měření anti-dsDNA bude provedeno imunofluorescenční technikou, kde titr 1/40 nebo více je považován za pozitivní)
• Hladina komplementu v séru (C3 a C4).

Pacienti T1D:

• Hladiny C-peptidu nalačno,
• glukózy nalačno, HbA1c a
• Autoprotilátky T1D [autoprotilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové (anti-GAD65), autoprotilátky inzulínu (IAA), protilátky inzulínového antigenu 2 (IA2) nebo autoprotilátky transportéru zinku 8 (anti-ZnT8)].

Pokud jde o krevní vzorky: náš plán ohledně frekvence a množství krevních vzorků je následující:

A- Frekvence:

• Základní linie pro CBC, KFT, LFT, elektrolyty, po 3 měsících a po 6 měsících intervence.
• Detekce počtu T reg před infuzí, po třech měsících a po 6 měsících
• V případě nežádoucích účinků 2. nebo více.

B- Částka:

• Pro vyhodnocení a přípravu základní linie: 6 ml (2 ml * 3 zkumavky). Stejné množství po 3 měsících a po šesti měsících infuze T reg.
• Detekce počtu T reg: 4 ml (2 ml* 2 zkumavky) pro hematologii a chemii.
• Separace T reg buněk Pro kultivaci a expanzi: (400 ml)
• V případě nežádoucích účinků: podle klinické indikace od 2 ml do 4 ml. Identifikace a počet regulačních T buněk (Tregs)(10) Identifikace a počet pomocí průtokové cytometrie pro lidské Tregs budou založeny na pozitivních i negativních buněčných markerech, lidské Tregs jsou (CD4+, CD25+, CD127-, Foxp3+).

Kryokonzervace Expandovaných Tregů:

Aby se umožnila několikanásobná infuze buněčného produktu, bude využita proveditelnost kryokonzervace Treg. Kryokonzervace Tregs umožňuje flexibilitu při podávání, což pomáhá s klinickými cestami a usnadňuje dokončení všech požadovaných testů uvolňování. ( 10 ) Podávání T reg buněk a sledování nežádoucích příhod Před infuzí buněk budou přezkoumány výsledky krevní chemie a hematologie a bude získána anamnéza jakéhokoli nedávného onemocnění nebo horečky. Pacienti dostanou premedikaci paracetamolem a difenhydraminem. Poly t regs budou podávány periferní intravenózní linkou po dobu 10 až 30 minut.

Vitální funkce budou odebírány před a po infuzi, poté každých 15 minut po dobu alespoň 1 hodiny, poté každou hodinu po dobu prvních 4 hodin a každé 4 hodiny po dobu 20 hodin. Chemie a kompletní krevní obraz s diferenciálním krevním obrazem budou opakovány následující den před propuštěním z klinické výzkumné jednotky. Pacienti budou sledováni 4. den po infuzi, poté jednou týdně po dobu 4 týdnů, poté po 13 týdnech a poté po 26 týdnech. Telefonické monitorování nežádoucích účinků bude pokračovat jeden rok po infuzi, po které bude následovat poslední návštěva kliniky.

Dávka ex vivo expandovaného T reg bude stejná pro všechny pacienty. Bude podáván ve zvyšujících se dávkách 5x10^6-1x10^8 buněk I V infuze IV infuze. Je to minimální dávka v předchozích mezinárodních terapeutických kohortách pro dosažení bezpečnosti (14).

ETICKÉ ÚVAHY

1. RIZIKA a MINIMALIZACE RIZIK:

   • Možná rizika ultrazvukového lékařského zobrazování: Ultrazvukové lékařské zobrazování je rychlý a bezpečný způsob hodnocení pacientů, který nepředstavuje žádné riziko a nevede k nežádoucím účinkům. Nevedou k žádné změně původního stavu pacienta, ale mohou se vyskytnout vzácné problémy jako: bolest nebo modřiny.
   • Komplikace venepunkce: tvorba hematomu, poškození nervů, bolest, hemokoncentrace, extravazace, iatrogenní anémie, arteriální punkce, petechie, infekce, synkopa a mdloby, nadměrné krvácení, otoky a tromby. Aby se tato rizika minimalizovala, bude ji přijímat kvalifikované sestry za aseptických podmínek.

   • Riziko infekce: Izolace a expanze buněk T reg bude prováděna v přísně sterilizovaném prostředí. Během expanze a kontroly kvality budou dodržovány časté techniky sterility a před adoptivním přenosem T buněk budou provedeny testy uvolňování.

     ● Nežádoucí účinky odebrání 400 ml krve pacientům: jako při dárcovství krve, které jsou vzácné a zahrnují vznik lokálního traumatického hematomu po vyjmutí jehly ze žíly. Přidržování místního tlaku a aplikace ledu nebo studených obkladů na oblast může pomoci zabránit rozvoji nebo progresi hematomů. Tyto hematomy jsou obvykle malé a nezpůsobují větší problémy. Může se také objevit závrať, pocení a synkopa, kterým se lze vyhnout tím, že pacient bude muset sedět několik minut v nakloněné poloze, a pokud je to možné, pomalu se přesunout do vzpřímené polohy a přesunout se do oblasti, kde mu bude podáno něco k jídlu a pití. Během několika hodin po odběru krve bude podporován zvýšený příjem tekutin. Hladina Hb u pacienta před odběrem krve pro izolaci Treg nesmí být nižší než 11 g/dl. vyšetřovatelé připraví zabalené erytrocyty před odběrem krve, aby mohly být podány, pokud je to klinicky indikováno.

   • Riziko infekce / zánětu: Izolace a expanze buněk Treg bude prováděna v přísně sterilizovaném prostředí. Během expanze a kontroly kvality budou dodržovány časté techniky sterility a testy uvolňování budou provedeny před adoptivním přenosem T buněk. Přijatá kritéria uvolňování zahrnují: Fenotyp>60 %, , životaschopnost:> 70 %, sterilita a negativní mykoplazma.

2. KRITÉRIA UKONČENÍ (UKONČENÍ STUDIA A ZÁPISU) Pravidla bezpečného zastavení pro jednotlivé předměty

   Léčba bude přerušena u každého subjektu, který prodělá některý z následujících stavů:

   • Jakákoli SAE nebo klinicky významná AE 4. stupně nebo potvrzená laboratorní abnormalita 4. stupně u jednotlivého subjektu, o kterých se zkoušející domnívá, že mají rozumnou možnost příbuznosti s infuzí T reg. Subjektivní klinické příznaky neodrážející hlavní orgánovou dysfunkci, jako je silná bolest hlavy, mohou, ale nemusí odůvodňovat přerušení léčby podle úsudku zkoušejícího.
   • Subjekty mohou kdykoli dobrovolně přerušit léčbu nebo odstoupit ze studie.
   • Mohou být také kdykoli odstraněni ze studie, pokud zkoušející usoudí, že pokračování studie by vedlo k významnému bezpečnostnímu riziku pro subjekt.
   • Přetrvávající nedodržování požadavků protokolu Subjekty, které předčasně přeruší studijní léčbu, by měly být povzbuzovány, aby dodržovaly stejný protokolový rozvrh a hodnocení, jaká jsou popsána pro další sledování klíčových výsledků studie.

   Pravidla pro zastavení studia

   Toto klinické hodnocení bude pozastaveno z některého z následujících důvodů:

   • Smrt u jakéhokoli subjektu, u kterého je příčina smrti posouzena jako důvodně spojená s intervencí výzkumníka ve studii.
   • >20 % zapsaných subjektů má klinicky významné AE 3/4 nebo potvrzené laboratorní abnormality 3/4 stupně, které zkoušející považuje za rozumnou možnost spojitosti se studijní intervencí.
   • Zkoušející budou informovat etickou komisi se všemi podrobnostmi o každém pacientovi zahrnutém do studie zastaví studii, jakmile nás etická komise informuje, abychom zastavili v souladu s pravidly komise.

3. VÝHODY:

   Přímé výhody pro pacienty:

   • Remise autoimunitní poruchy pacientů přímo infuzí T regulačních buněk. Bude kontrolováno zjištěním závažnosti onemocnění a skóre aktivity a následnými vyšetřeními.
   • Adoptivní přenos T buněk poskytne pacientům s refrakterním autoimunitním onemocněním šanci na kontrolu.

   Nepřímé výhody

   • Adoptivní přenos T reg buněk umožňuje kontrolu autoimunitního onemocnění bez globálního potlačení imunitního systému imunosupresivními léky.
   • Přenos Treg pomáhá při kontrole autoimunitních onemocnění a chrání pacienty před chronickou progresivní morbiditou a mortalitou.
   • Vzhledem k tomu, že není drahá ve srovnání s jinými možnostmi léčby, dosahuje cenové dostupnosti.
   • Adoptivní Treg buňky jsou autologní s menší náchylností k nežádoucím účinkům (dosahující bezpečnosti).
   • Být velkou nadějí pro pacienty s pokročilými autoimunitními onemocněními, kteří jsou refrakterní na konvenční dostupnou léčbu a nemohli dosáhnout jiných nedostupných léčebných možností uvedených v mezinárodních doporučeních. V takových pokročilých stádiích mohou adoptivní T buňky nabídnout více zlepšení kvality života pacientů, snášenlivosti a kompliance.
   • Pozitivní výsledky této studie vysoce přispívají k blahobytu egyptských občanů
   • Pomoc významné podskupině pacientů s pokročilými autoimunitními chorobami cenově dostupnou léčbou sníží finanční zátěž egyptské vlády.
   • Nabídka takové inovativní linie léčby pro autoimunitní pacienty zvýší pozici univerzit v zemi mezi jejich protějšky po celém světě.
   • Široké kroky v této oblasti by nás mohly dovést ke stanici využití adoptivního přenosu T buněk k prevenci autoimunitních onemocnění před splněním kritérií pro diagnostiku onemocnění nebo dokonce k zachování centrální tolerance a prevenci výskytu těchto onemocnění. To bude považováno za obrovský krok v oblasti autoimunitních onemocnění.
4. SOUKROMÍ A DŮVĚRNOST Vyšetřovatelé budou jednat v naprosté důvěrnosti a nikdo nemá právo číst informace o našich pacientech kromě hlavního výzkumníka. Po dokončení výzkumu budeme informováni o výsledcích výzkumu našeho pacienta a také o dalších informacích týkajících se zdravotního stavu našeho pacienta. Ve všech publikovaných a písemných datech vyplývajících ze studie bude zachována mlčenlivost jednotlivců.

5. Alternativy k účasti:

   Pacient má právo studii kdykoli odmítnout nebo z ní odstoupit. V případě odmítnutí účasti na tomto výzkumu bude pacient sledován a dostane svou léčbu podle plánu. Pacient může kdykoli ukončit účast ve studii, aniž by došlo k dostatečné nebo ztrátě lékařské péče.

6. POSTUPY SOUHLASU:

Nemocnice pro revmatologii a endokrinologii (ASU) získají písemný souhlas. Souhlas provede uvedený zkoušející pacientovi při první návštěvě. Gramotným osobám bude souhlas přečten a následně jeho vysvětlení zmíněným vyšetřovatelem, negramotným osobám bude souhlas rovněž přečten a vysvětlen.