Transferência Autóloga Adotiva de Células T Reguladoras em Doenças Autoimunes.

Distúrbios autoimunes são doenças crônicas causadas pela quebra da tolerância contra autoantígenos

; uma hipótese envolve uma falha na tolerância central e periférica, sendo que esta última está associada ao número reduzido de células Treg (CD4+CD25+FpxP3CD127- T- Regulatory ) ou falha em sua função (6).

Em estudos pré-clínicos, as células Treg humanas CD4+CD25+CD127- demonstraram ser eficazes na prevenção da doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD) (7, 23), doenças autoimunes (13,22) e retardando a rejeição do enxerto (19, 26 ).

Os resultados positivos deram a justificativa para aplicar células Treg para o tratamento de doenças humanas e resultados dos primeiros ensaios clínicos com pesquisadores de células Treg transferidas adotivamente publicados em 2009 (24).

O que este estudo acrescenta? Este é o primeiro estudo de intervenção sobre a transferência adotiva de células Treg no Egito como um ensaio terapêutico para pacientes com doenças autoimunes refratárias que não respondem à linha de base do tratamento disponível no instituto. A separação dessas células Treg foi feita em pacientes egípcios, mas apenas como um estudo descritivo (como mencionado abaixo).

os investigadores escolhem duas doenças para dar alguma chance de sucesso para obter fundos de nossa pesquisa, já que seu custo é caro. Os investigadores escolheram essas duas doenças (nefrite lúpica refratária e diabetes tipo 1 em adultos, pois são os ensaios mais comuns em publicações internacionais).

os investigadores avaliarão a segurança e a eficácia da transferência de células Treg autólogas adotivas (CD4CD25FoxP3 CD127 de baixa regulação) para pacientes com doenças autoimunes refratárias: nefrite lúpica refratária e diabetes mellitus tipo 1 em adultos.

2. PERGUNTA/OBJETIVOS DO ESTUDO Os investigadores avaliarão a segurança e a eficácia da transferência de células Treg autólogas adotivas (CD4CD25FoxP3 CD127baixa regulação) para pacientes com LES com nefrite lúpica refratária e pacientes com diabetes mellitus tipo 1 adulto.

O plano de monitoramento de EA está documentado no protocolo de verificação de eventos adversos sistêmicos e locais usando CTCAE(5). As avaliações de segurança consistirão em monitoramento contínuo e notificação de eventos adversos (EAs) (com visitas mensais ou conforme indicação clínica por contato móvel ou externo visitas de pacientes); monitoramento de sinais vitais, exames físicos e avaliações laboratoriais. Documentação precisa e gerenciamento adequado serão feitos para qualquer EA que possa ocorrer (nas unidades ambulatoriais e de internação, conforme indicado). Os pacientes serão vistos mensalmente para detecção de qualquer evento adverso ou conforme avaliação clínica pelo contato da Mobil.

1. Contagem de glóbulos brancos (WBC) com contagem diferencial, contagem de glóbulos vermelhos (RBC), contagem de plaquetas (PLT), hemoglobina (Hb) e hematócrito (Hct).

2. Funções hepáticas, testes de funções renais e medição de eletrólitos.

   Eficácia da transferência adotiva de células Treg:

   • Avaliação clínica: anamnese completa e exame clínico completo com avaliação do escore de atividade da doença (clínica e laboratorial) para comparar com os dados basais.

   • Exames laboratoriais de acordo com o tipo de doença autoimune:

     1. Exames laboratoriais para detecção de exacerbação da doença,
     2. CD4CD25FoxP3,CD127baixa contagem de células na amostra de sangue periférico,
     3. Detecção de citocinas séricas (INF-gama,TNF-alfa,IL1,IL2,TGF-beta,IL-10,IL-17)

   • Avaliação radiológica se necessária de acordo com o tipo de doença autoimune:

     1. ultrassom
     2. tomografia computadorizada
   • Os pesquisadores detectarão a eficácia da infusão de células T reg após 3 meses, após 6 meses e após um ano de administração.
3. METODOLOGIA:

Tipo de estudo: Estudo piloto de fase 1 de rótulo aberto não randomizado Cenário do estudo: Tabela de responsabilidades (Tabela 1): veja abaixo Duração do estudo: Dois anos.

População do estudo:

• Dez pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) com nefrite lúpica refratária: critérios de inclusão e exclusão
• Dez pacientes diabéticos tipo 1: critérios de inclusão e exclusão

Método de amostragem:

Amostras intencionais seguindo critérios de inclusão e exclusão pré-estabelecidos.

Tamanho da amostra:

Os pesquisadores incluirão dez pacientes em cada doença autoimune como um estudo piloto.

Procedimentos de estudo:

• Primeira visita: A equipe de reumatologia e a equipe de endocrinologia selecionarão os pacientes de acordo com os critérios acima mencionados do departamento de medicina interna dos hospitais da ASU. As investigações laboratoriais e imunológicas completas serão feitas nos laboratórios centrais do Hospital ASU. As enfermeiras do ambulatório médico dos Hospitais da ASU coletarão as amostras de sangue de todos os casos. Os pacientes farão todas as modalidades de imagem necessárias no departamento de radiodiagnóstico do ASU Hospital. A equipe de reumatologia e a equipe de endocrinologia obterão um consentimento por escrito de todos os pacientes incluídos no estudo.
• Segunda visita: Após a primeira visita por uma semana. O paciente virá para o departamento de medicina interna. Todos os pacientes serão avaliados clinicamente, laboratorialmente e radiologicamente conforme indicado para detecção da gravidade ou atividade da doença. O paciente irá para o centro de pesquisa médica para coleta de sangue periférico em condições estéreis para separação de células Treg. A distância entre o centro de pesquisa e os departamentos médicos é de cerca de 200 m. O carro de transferência do hospital levará o paciente (carro de golfe) por 150 m após caminhar por 50 m.
• Terceira visita: (após a segunda visita por seis semanas): o paciente chegará ao Centro de Pesquisa Médica para Admissão sob supervisão da equipe de Alergia e Imunologia para administração de infusão de células T reg. A equipe de Alergia e Imunologia acompanhará o paciente por 24 horas após a infusão.
• A detecção de eventos adversos será verificada mensalmente. O contato móvel entre o paciente e as equipes de reumatologia, endocrinologia e imunologia clínica será mantido para registro de qualquer evento adverso.
• Quarta visita: (após três meses da terceira visita): A equipe médica fará acompanhamento laboratorial, imunológico e radiológico completo no laboratório central da ASU e no departamento de radiologia da ASU após três meses de infusão de T reg. A pontuação clínica e a detecção da atividade e gravidade da doença serão registradas.
• Quinta visita após seis meses de infusão. O mesmo será feito como visita 4.
• Visita final após um ano para detecção de qualquer evento adverso.
• O comitê de ética será informado por um relatório completo incluindo todos os dados clínicos e laboratoriais sobre as últimas seis etapas para cada paciente que recebeu a infusão de células t reg conforme registrado pelas equipes de imunologia, reumatologia e endocrinologia. A Figura 2 mostra o esquema de procedimentos e acompanhamento.

Todos os pacientes serão submetidos ao seguinte:

Na primeira visita

• Anamnese completa e exame clínico, incluindo avaliação da gravidade e pontuação da atividade clínica da doença de acordo com o tipo de doença autoimune.
• Investigações pré-tratamento CBC com contagem diferencial de WBCS, linfócitos totais, contagem de glóbulos vermelhos (RBC), contagem de plaquetas (PLT), hemoglobina (Hb) e hematócrito (Hct)
• funções hepáticas, testes de função renal e avaliação de eletrólitos (Na, K e Ca).
• Testes de função hepática: albumina sérica ,PT e INR .bilirrubina total e direto .AST ,ALT, fosfatase alcalina ,albumina sérica.
• Testes de função renal (creatinina sérica, BUN) e eletrólitos (sérico Na, K e, Ca)
• VHS e PCR.
• Avaliação da contagem de células CD4+CD25+FoxP3+CD127- antes da intervenção, após três meses e após 6 meses da intervenção por citometria de fluxo.
• Testes sorológicos para todos os pacientes: INF-gama, TNF-alfa, IL-17, IL-2, IL-10 e TGF-beta. Todas as citocinas serão feitas por teste de ELISA antes da transfusão adotiva de T reg, após 3 meses e após 6 meses de transfusão.
• Investigações radiológicas de acordo com o tipo de doença autoimune e se indicado.
• Exames laboratoriais de acordo com a doença autoimune:

Pacientes com LES:

• Glicemia em jejum e 2 h pós-prandial, hemograma completo (CBC), análise completa de urina,
• Dosagem de proteínas na urina de 24 h (g/24 h).
• Título e padrão de anticorpos antinucleares (ANA) e anticorpos anti-DNA de dupla fita (a dosagem de anti-dsDNA será feita pela técnica de imunofluorescência, onde o título de 1/40 ou mais é considerado positivo)
• Nível de complemento sérico (C3 e C4).

Pacientes com DM1:

• Níveis de peptídeo C em jejum,
• glicemia de jejum, HbA1c e
• Os níveis de autoanticorpo T1D [autoanticorpo descarboxilase de ácido glutâmico (anti-GAD65), autoanticorpo de insulina (IAA), anticorpo de antígeno de insulina 2 (IA2) ou transportador de zinco 8 autoanticorpo (anti-ZnT8)] serão medidos.

Em relação às amostras de sangue: nosso plano em relação à frequência e quantidade de amostras de sangue é o seguinte:

A- Frequência:

• Linha de base para CBC, KFT, LFT, eletrólitos, após 3 meses e após 6 meses de intervenção.
• Detecção da contagem de T reg antes da infusão, após três meses e após 6 meses
• Em caso de eventos adversos de grau 2 ou mais.

B- Quantidade:

• Para avaliação e preparação da linha de base: 6 ml (2ml * 3 tubos). A mesma quantidade após 3 meses e após seis meses de infusão de T reg.
• Detecção de contagem T reg: 4 ml (2 ml* 2 tubos) para hematologia e química.
• Separação de Células T reg Para cultivo e expansão: ( 400ml )
• Em caso de eventos adversos: conforme indicação clínica, de 2 ml a 4 ml. Identificação e contagem de células T reguladoras (Tregs)(10) A identificação e contagem, usando a citometria de fluxo, para Tregs humanas serão baseadas em marcadores de células positivas e negativas, Tregs humanas são (CD4+, CD25+, CD127-, Foxp3+).

Criopreservação de Tregs expandidas:

Para permitir a infusão do produto celular várias vezes, será utilizada a viabilidade da criopreservação de Treg. A criopreservação de Tregs permite flexibilidade na administração para auxiliar nas vias clínicas e facilita a conclusão de todos os ensaios de liberação necessários. ( 10 ) Administração de células T reg e acompanhamento de eventos adversos Os resultados da química do sangue e hematologia serão revisados, e uma história de qualquer doença recente ou febre será obtida antes da infusão das células. Os pacientes receberão pré-medicação com paracetamol e difenidramina. Poly t regs será infundido através de uma linha intravenosa periférica durante 10 a 30 min.

Os sinais vitais serão medidos antes e depois da infusão, depois a cada 15 minutos por pelo menos 1 hora, depois a cada hora nas primeiras 4 horas e a cada 4 horas por 20 horas. Química e hemograma completo com hemograma diferencial serão repetidos no dia seguinte antes da alta da unidade de pesquisa clínica. Os pacientes serão vistos para avaliações de acompanhamento no dia 4 após a infusão, depois semanalmente por 4 semanas, depois de 13 semanas e depois de 26 semanas. O monitoramento telefônico para eventos adversos continuará um ano após a infusão, seguido por uma visita clínica final.

A dose de T reg expandida ex-vivo será a mesma para todos os pacientes. Será administrado em doses crescentes de 5x10^6-1x10^8 células I V infusion I V infusion. É a dose mínima em coortes terapêuticas internacionais anteriores para alcançar a segurança (14).

CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

1. RISCOS e MINIMIZAÇÃO DE RISCOS:

   • Possíveis riscos da imagem médica por ultrassom: A imagem médica por ultrassom é uma forma rápida e segura de avaliar pacientes que não representam nenhum risco e não levam a efeitos colaterais. Eles não levam a nenhuma alteração na condição original do paciente, mas podem ocorrer problemas raros como: dor ou hematomas.
   • Complicações da punção venosa: formação de hematoma, lesão nervosa, dor, hemoconcentração, extravasamento, anemia iatrogênica, punção arterial, petéquias, infecção, síncope e desmaios, sangramento excessivo, edema e trombos. Para minimizar estes riscos será tomado em condições assépticas por enfermeiros qualificados.

   • Risco de infecção: O isolamento e a expansão das células T reg serão feitos em ambiente estritamente esterilizado. Técnicas de esterilidade frequentes serão seguidas durante a expansão e controle de qualidade, e ensaios de liberação serão feitos antes da transferência de células T adotivas.

     ● Efeitos colaterais da coleta de 400 cc de sangue de pacientes: como o da doação de sangue, que são raros e incluem o desenvolvimento de um hematoma traumático local quando a agulha é removida da veia. Manter a pressão local e aplicar gelo ou compressas frias na área pode ajudar a prevenir o desenvolvimento ou progressão de hematomas. Esses hematomas geralmente são pequenos e não causam grandes problemas. O desenvolvimento de tontura, sudorese e síncope também pode ocorrer e pode ser evitado exigindo que o paciente se sente em posição reclinada por alguns minutos e, quando possível, movendo-se lentamente para a posição ereta e movendo-se para uma área onde serão administrados algo para comer e beber. O aumento da ingestão de líquidos será incentivado nas poucas horas após a coleta de sangue. O nível de Hb do paciente não deve ser inferior a 11g/dl antes da coleta de sangue para isolamento de Treg. os investigadores prepararão hemácias empacotadas antes da coleta de sangue para serem administradas se indicado clinicamente.

   • Risco de infecção/inflamação: O isolamento e a expansão das células Treg serão feitos em ambiente estritamente esterilizado. Técnicas de esterilidade frequentes serão seguidas durante a expansão e controle de qualidade, e ensaios de liberação serão feitos antes da transferência de células T adotivas. Os critérios de liberação aceitos incluem: Fenótipo>60%, viabilidade:> 70%, esterilidade e micoplasma negativo.

2. CRITÉRIOS DE DESCONTINUAÇÃO (RESCISÃO DO ESTUDO E DA INSCRIÇÃO) Regras de Parada de Segurança para Sujeitos Individuais

   O tratamento será descontinuado em qualquer sujeito que apresentar qualquer um dos seguintes:

   • Qualquer SAE, ou um AE de grau 4 clinicamente significativo ou anormalidade laboratorial de grau 4 confirmada para um indivíduo individual, que seja considerado pelo investigador como tendo uma possibilidade razoável de relação com a infusão de T reg. Sintomas clínicos subjetivos que não reflitam disfunção orgânica importante, como dor de cabeça intensa, podem ou não justificar a descontinuação do tratamento no julgamento do investigador.
   • Os sujeitos podem interromper voluntariamente o tratamento ou retirar-se do estudo a qualquer momento.
   • Eles também podem ser removidos do estudo a qualquer momento se o investigador determinar que a continuação do estudo resultaria em um risco de segurança significativo para o sujeito.
   • Não conformidade persistente com os requisitos do protocolo Os participantes que descontinuarem prematuramente o tratamento do estudo devem ser encorajados a manter o mesmo cronograma de protocolo e avaliações conforme descrito para acompanhamento contínuo para os principais dados do resultado do estudo.

   Regras de Parada de Estudo

   Este ensaio clínico será interrompido por qualquer um dos seguintes motivos:

   • Morte em qualquer indivíduo em que a causa da morte seja considerada como tendo uma possibilidade razoável de relação com a intervenção do estudo pelo investigador.
   • >20% dos indivíduos inscritos apresentam EAs de grau 3/4 clinicamente significativos ou anormalidades laboratoriais de grau 3/4 confirmadas consideradas pelo investigador como tendo uma possibilidade razoável de relação com a intervenção do estudo.
   • Os investigadores informarão o comitê de ética com todos os detalhes de cada paciente incluído no estudo. interromperá o estudo assim que o comitê de ética nos informar para parar de acordo com as regras do comitê.

3. BENEFÍCIOS:

   Benefícios diretos para os pacientes:

   • Remissão do distúrbio autoimune dos pacientes diretamente por células T reguladoras infundidas. Será verificado pela detecção da gravidade da doença e escores de atividade e investigações de acompanhamento.
   • A transferência adotiva de células T dará uma chance de controle aos pacientes com doenças autoimunes refratárias.

   Benefícios indiretos

   • A transferência adotiva de células T reg permite o controle de doenças autoimunes sem supressão global do sistema imunológico por medicamentos imunossupressores.
   • A transferência de Tregs ajuda no controle de doenças autoimunes e protege os pacientes de morbidade e mortalidade progressiva crônica.
   • Não ser caro em comparação com outras opções de tratamento faz com que seja acessível.
   • As células Treg adotivas são autólogas com menor suscetibilidade a eventos adversos (obtendo segurança).
   • Sendo uma grande esperança para os pacientes com doenças autoimunes avançadas, refratários ao tratamento convencional disponível, e que não conseguiram alcançar outras opções de tratamento indisponíveis listadas nas diretrizes internacionais. Em estágios tão avançados, as células T adotivas podem oferecer mais melhorias na qualidade de vida, tolerabilidade e adesão dos pacientes.
   • Os resultados positivos deste estudo contribuem muito para o bem-estar dos cidadãos egípcios
   • Ajudar um subconjunto significativo de pacientes com doenças autoimunes avançadas com um tratamento acessível reduzirá o fardo financeiro do governo egípcio.
   • Oferecer essa linha inovadora de tratamento para pacientes autoimunes elevará a classificação das universidades do país entre suas contrapartes em todo o mundo
   • Dar passos largos nesse campo poderia nos levar à estação de usar a transferência adotiva de células T para prevenir doenças autoimunes antes de completar os critérios para o diagnóstico da doença, ou mesmo conservar a tolerância central e prevenir a ocorrência dessas doenças. Isso será considerado um passo gigantesco no campo das doenças autoimunes.
4. PRIVACIDADE E CONFIDENCIALIDADE os investigadores lidarão com total confidencialidade e ninguém tem o direito de ler as informações médicas de nossos pacientes, exceto o pesquisador principal. Após a conclusão da pesquisa, os resultados da pesquisa de nosso paciente e também mais informações sobre o estado de saúde de nosso paciente serão informados. A confidencialidade dos indivíduos será mantida em todos os dados publicados e escritos resultantes do estudo.

5. Alternativas para participar:

   O paciente tem o direito de recusar ou retirar-se do estudo a qualquer momento. Em caso de recusa em participar desta pesquisa, o paciente será acompanhado e receberá seu tratamento conforme planejado. O paciente pode interromper a participação no estudo a qualquer momento sem excesso ou perda de cuidados médicos do paciente.

6. PROCEDIMENTOS DE CONSENTIMENTO:

Os hospitais de investigadores de reumatologia e endocrinologia (ASU) obterão um consentimento por escrito. O consentimento será conduzido ao paciente pelo investigador mencionado durante a primeira visita. Os indivíduos alfabetizados serão deixados para ler o consentimento seguido de sua explicação pelo investigador mencionado, enquanto os indivíduos analfabetos terão o consentimento lido e explicado a eles também.