Scansione del fuso meiotico nelle tecniche di riproduzione assistita per valutare la qualità degli ovociti (SMART)

Una delle principali strategie di trattamento dell’infertilità è la fecondazione in vitro (IVF). Il tasso di successo della fecondazione in vitro è influenzato da diversi fattori chiave tra cui l’età delle donne, la qualità degli ovociti e lo stato di maturazione, nonché la qualità dello sperma. Diversi autori hanno suggerito che la presenza, la posizione e il ritardo del fuso meiotico (MS) otticamente birifrangente sono correlati alla competenza di sviluppo dell'ovocita, influenzando la qualità della fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Gli ovociti con morfologia del fuso normale hanno una probabilità significativamente maggiore di produrre embrioni euploidi rispetto agli ovociti con fusi meiotici non visibili o anormali. È stato anche proposto di regolare i tempi di iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi (ICSI) in base alla morfologia della SM. È stato dimostrato che aggiustare il tempo dell’ICSI in base alla posizione della MS rispetto al corpo polare (PB) aumenta la probabilità di successo della fecondazione per le donne di età superiore ai 35 anni. Per gli ovociti delle pazienti di età superiore ai 35 anni, il tempo di incubazione più lungo ha consentito a un maggior numero di ovociti di diventare completamente maturi (fase MII) e preparati per l'ICSI. In questa situazione, lo stato della SM era un indicatore importante dell’immaturità degli ovociti.

Il paziente verrà randomizzato in tre gruppi utilizzando Research Electronic Data Capture (REDCap): gruppo 1, ICSI standard senza imaging MS; gruppo 2, imaging MS seguito da ICSI standard, gruppo 3, imaging MS e fecondazione ICSI in base allo stato di SM. Gli ovociti dei pazienti del gruppo 3 con valutazione della SM verranno fecondati in base allo stato della SM 5-6 ore dopo il prelievo dell'ovulo (OPU) o 7-8 ore dopo l'OPU. Gli ovociti senza valutazione MS verranno tutti fecondati 5-6 ore dopo l'OPU. La valutazione della MS avrà luogo in piastre con fondo di vetro pre-preparate con circa 5μl di terreno con il tampone HEPES ricoperto di olio di paraffina, messo a scaldare un'ora prima dell'uso. L'ovocita verrà ruotato utilizzando un ago in modo che il corpo polare (PB) e il MS siano entrambi ben visibili e le fotografie verranno scattate utilizzando il microscopio ottico. Lo stato MS e l'angolo (α) tra MS e PB saranno ottenuti 3-4 ore dopo il prelievo degli ovociti (OPU). Contemporaneamente verrà acquisita l’immagine al microscopio a luce polarizzata (microscopia a luce polarizzata con ingrandimento 100×. In particolare, per gli ovociti dei pazienti del gruppo 3 con PB/MS in stretta prossimità (angolo tra PB e MS < 5◦) o MS non visibili saranno previsti come ovociti immaturi. Per questi ovociti, l'ICSI verrà eseguita 4-5 ore dopo la valutazione al microscopio di polarizzazione, ovvero 7-8 ore dopo l'OPU. Per gli ovociti con MS chiaramente visibile e PB/MS non in stretta prossimità (angolo tra PB e MS > 5◦) l'ICSI verrà eseguita tipicamente 2-3 ore dopo la valutazione al microscopio di polarizzazione, cioè 5-6 ore dopo l'OPU, come per pazienti da 1 e 2 gruppi. L'ICSI sarà eseguita secondo il protocollo standard utilizzando micropipette ICSI/holding (Microtech IVF, Repubblica Ceca), polivinilpirrolidone (ICSI™, Vitrolife, Svezia) e sistema di micromanipolazione Eppendorf (Amburgo, Germania) dotato di termopiastra (Tokaohit, Giappone). Gli ovociti verranno coltivati ​​individualmente e il loro ordine verrà preservato, in modo che gli altri risultati (dati dal timelapse, risultati clinici) possano essere associati ai singoli ovociti. Monitoreremo anche il tempo che intercorre tra la somministrazione della gonadotropina corionica umana (hCG) e il completamento della fecondazione vera e propria. Gli ovociti verranno denudati (HYASE-10X™, Vitrolife, Svezia) dopo l'OPU e verrà esaminato lo stadio di maturazione. Gli ovociti allo stadio di vescicola germinale (GV) non saranno inclusi. Ovociti ed embrioni nell'incubatrice time-lapse del produttore giapponese Astec saranno coltivati ​​in una piastra timelapse Origio, Danimarca Sage 1-Step™, Origio, Danimarca sotto olio di paraffina (OVOIL™, VITROLIFE, Svezia) a 37,0 °C, 6% CO2 e 5%O2. La fecondazione dopo l'ICSI sarà definita come la presenza di due pronuclei e 2 corpi polari 16-20 ore dopo l'ICSI. Gli embrioni verranno coltivati ​​per 122-144 h.

I risultati pilota saranno confermati in uno studio di controllo randomizzato, ovvero verrà valutata l'efficienza dell'utilizzo della visibilità della SM e della posizione relativa rispetto al corpo polare come indicatori della maturazione degli ovociti al fine di ottimizzare i tempi dell'ICSI.