関節リウマチと強直性脊椎炎の骨細胞活性の違い

目的:

1. RA、AS、および健康なドナーの患者における骨代謝回転の調節における免疫系細胞の影響を評価します (タスク 2)。
2. 破骨細胞前駆体と、RA、AS、および健康なドナーの患者のサブグループにおける完全に機能する破骨細胞への分化を分析します (タスク 3、4、および 6)。
3. RA および AS 患者のサブグループにおける骨芽細胞の分化能および活性の研究 (タスク 5 および 6)
4. TNF 遮断薬で治療された RA および AS 患者のサブグループにおける骨細胞の分化および機能に対する治療の効果を評価します (タスク 2、3、4、および 5)。

作業プログラムとタイムテーブル 開始日: 2011 年 7 月。 終了日: 2013 年 7 月 タスク 1 - 患者 RA と診断された患者 (改訂されたアメリカ リウマチ協会の基準、1988 年による) および AS と診断された患者 (欧州脊椎関節症研究グループの基準、1991 年による) は、リウマチ学および骨および代謝疾患でフォローアップされました。サンタマリア病院（HSM）の部門がこの研究のために募集されます。 活動性RA（疾患活動性スコア28（DAS28）> 3.2）の25人の患者および活動性AS（バス強直性脊椎炎疾患活動指数（BASDAI）> 4）の25人の患者が研究に含まれます。 性別と年齢が一致した15人の健康なドナーが募集され、対照群として使用されます。

患者は、性別、年齢、疾患期間、以前の治療法、リウマチ因子および抗環状シトルリン化ペプチド抗体の存在、ヒト白血球抗原 (HLA)-B27 の状態、DAS28 スコア、および健康評価アンケートに関する情報を含む臨床プロトコルに提出されます。 - HAQ (健康評価アンケート、RA 患者用)、BASDAI、マーストリヒト強直性脊椎炎付着炎スコア (MASES)、バス強直性脊椎炎機能指数 - BASFI (AS 患者用) および強直性脊椎炎疾患活動性スコア (ASDAS)。 血液は、グルココルチコイドおよび疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD：メトトレキサート、スルファサラジン、およびレフルノミド）による治療を開始する前、およびこれらの薬の安定した用量に達してから3か月後に患者から採取されます。 後者の方は、治療開始から 6 か月後に TNF 遮断薬の血液サンプルを採取します。 この最初のコホートの少数のみが TNF 拮抗薬で治療する必要があると予想されるため、TNF 拮抗薬を開始するために選択された 25 人の RA 患者と 25 人の AS 患者の第 2 のグループは、薬物を開始する前と 6 か月後に評価されます。

書面によるインフォームドコンセントは、プロトコル固有の手順の前にすべての患者から取得され、この研究は、東京で修正されたヘルシンキ宣言（2004）などの臨床試験を管理する規則に従って実施されます。 この研究は、HSM 倫理委員会によって承認されました。

以下のタスクのすべての手順は、別段の記載がない限り、RA および AS 患者 (血清および血液) と健康なドナー (血清) で実行されます。

タスク 2 - 炎症性刺激および骨代謝回転マーカーの研究 免疫系細胞の亜集団 (Th17 細胞を含む好中球、B および T 細胞亜集団) は、フローサイトメトリーによって表面 RANKL 発現について分析されます。

IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-20、IL-23、TNF、骨調節タンパク質（OPG、sRANKL、スクレロスチン、dickkopf-1）などの炎症誘発性サイトカインは、ELISA によって定量化されます。 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ (TRAP)5b などの骨分解酵素や、I 型コラーゲン カルボキシ末端架橋テロペプチド (ICTP) やプロコラーゲン 1 型アミノ末端プロペプチド (P1NP) などの骨代謝回転マーカーも研究されます。

フローサイトメトリー実験とタンパク質定量化から得られたデータは、治療前後の疾患間および健康なドナーと比較されます。 これにより、未治療の患者における全身および局所の炎症環境における疾患固有の違いと、この同じ環境に対するさまざまな治療法の効果を理解することができます。

タスク 3 - 破骨細胞前駆体とそれらの機能的破骨細胞への分化の分析 循環 CD14+ 細胞は、HLA-DR、分化クラスター (CD)16、CD86、CD11b、CD62L などのマーカー、および破骨細胞分化関連タンパク質を分析することによって特徴付けられます。フローサイトメトリーによる表面インテグリン CD51/CD61 (αVβ3 インテグリン)、RANK (nf-κ ベータの受容体活性化因子)、カルシトニン受容体など。

破骨細胞前駆体を完全に特徴付けるために、CD14+ 細胞における DC-STAMP、MITF (小眼球関連転写因子)、CTSK (カテプシン K)、TRACP、ATP6v0d2 などの破骨細胞関連遺伝子の発現をリアルタイムの定量的ポリメラーゼによって評価します。連鎖反応 (RT-qPCR)。 得られた結果は、ハウスキーピング遺伝子ベータ グルクロニダーゼ (GUSB) およびホスホマンノムターゼ-1 (PMM1) で正規化されます。

フローサイトメトリーおよび遺伝子発現実験から得られたデータは、治療を受けた患者と治療を受けていない患者、および健康なドナーと比較されます。 このタスクは、CD14 + 単球亜集団の疾患特異的な変化に関する定量的な情報を提供し、循環前駆細胞における治療の効果を理解することを可能にします。

タスク 4 - 分化した破骨細胞の機能と細胞動態分離された CD14+ 単球は、M-CSF (マクロファージコロニー刺激因子) および hrRANKL (nf-κ β リガンドのヒト組換え受容体活性化因子) の存在下、37°で 21 日間培養されます。 、マルチウェル培養プレートで 5% CO2。

細胞動態を評価するために、破骨細胞を培養の７、１４および２１日目に分析する。 破骨細胞特異的遺伝子の発現は、RT-qPCR によってこれらの時点で分析されます (タスク 3 を参照)。 ＣＤ５１／ＣＤ６１およびＲＡＮＫ表面発現を評価するために、フローサイトメトリー分析が実施される。 患者および健常対照者から時点（７、１４および２１日目）に得られたデータを、前駆細胞から得られた同じデータと比較する。

培養 21 日目に、細胞を 2 つの機能アッセイで使用します。TRAP 染色と吸収アッセイです。 TRAP 染色アッセイでは、3 つ以上の核を持つ TRAP 陽性多核細胞 (破骨細胞) を数えることによって、培養中に形成された破骨細胞の数を評価します。 この値を培養プレート内の CD14+ 単球の核数と比較することで、これらの前駆体の融合指数を決定することができます。 吸収アッセイは、骨スライス上で単球を培養することによって行われ、機能的な破骨細胞の吸収活性を測定することができます。 これは、吸収された領域が青から紫の色を獲得するトルイジンブルーで染色された骨スライスの画像分析によって測定されます。 前駆体の融合率および破骨細胞吸収領域の分析により、RAおよびAS患者と健康なドナーとの間の破骨細胞機能の違いを特定することができます。

単球と破骨細胞の両方が、RANK/RANKL、αVβ3 インテグリン、および TRAF6、チロシンキナーゼ Src、細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK)1/2 活性化 NF- kB およびその他の転写因子。 これらのシグナル伝達経路は、Luminex xMAP プラットフォームと EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore) を使用して研究されます。 未治療の患者とコントロールの結果を比較することで、RA と比較して AS の破骨細胞の分化/活性化の古典的経路に障害があるかどうかを理解することができます。

治療を受けた患者と治療を受けていない患者から得られた結果は、破骨細胞の分化と機能に対する治療の作用に関する洞察を提供します。 未治療の患者と健康なドナーの全体的な結果を比較することで、これらの病状における破骨細胞の分化と活性化の主な違いを理解することができます。

タスク 5 - 骨芽細胞の機能と細胞動態 人工股関節置換術または子宮頸部手術を受けた RA および AS 患者のサブグループで、骨芽細胞の分化が研究されます。 手術直後に、骨芽細胞を分離するために小柱骨（1cm3）の小片がサンプルから抽出されます。 分離後、骨芽細胞はビタミンD3（10-8M）を添加したダルベッコの最小必須培地（DMEM）で培養され、細胞は80％コンフルエンスで研究されます。 骨芽細胞の機能は、メチルチアゾール テトラゾリウム (MTT) アッセイ (細胞増殖)、アルカリホスファターゼ染色、石灰化結節形成によって in vitro で研究されます。 細胞は、RNA抽出および遺伝子発現分析にも使用されます。オステオポンチン、I型コラーゲン、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、RANKL、オステオプロテゲリン、runx2、およびオステリックスなどのタンパク質をコードする特定の遺伝子を分析して、単離された細胞を特徴付けます。 これらの結果は、疾患間の骨芽細胞の分化と活性の違いを理解することを可能にします。

タスク 6 - 骨遺伝子発現アッセイ 股関節置換術または子宮頸部手術を受けた RA および AS 患者のサブグループで、骨サンプルを -80ºC で凍結します。 骨がまだ凍結している状態で、小柱骨の少量のサンプルを極低温粉砕機で微粉末にし、TRIzol 試薬を使用して RNA 抽出を行います。 得られた RNA は、その完全性について評価され、バイオアナライザーで定量化されます。 したがって、抽出される RNA は、血液、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、骨髄細胞から、骨に存在する RNA の合計になります。

骨微小環境とインビトロ研究からの細胞の両方における遺伝子発現は、RT-PCRによって評価されます。 オステオポンチン、I 型コラーゲン、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、RANKL、オステオプロテゲリン、runx2、オステリックス、カテプシン K、ベータ 3 インテグリン サブユニット、カルシトニン受容体、ATPase サブユニット d2、TRAF6、RANK、TRAP など、骨芽細胞と破骨細胞の両方に由来するタンパク質をコードする特定の遺伝子、共受容体OSCARおよびTREM-2などが研究されます。 骨細胞の活性は、特定の遺伝子、SOST、Dkk1、DMP-1、Phex、E11 抗原、MEPE、および CD44 の発現によっても評価されます。 炎症性サイトカイン IL-1、IL-6、IL-17、および TNF をコードする遺伝子も研究されます。

PCR 効率を評価するために、標準曲線は、正常な骨密度を持ち、骨代謝に影響を与える可能性のある他の疾患のない個人の凍結骨サンプルから抽出した RNA から作成されます。 関心のある破骨細胞、骨芽細胞、および骨細胞遺伝子は、標準曲線法によって定量化されます。

骨サンプルの RNA 発現研究により、局所細胞の活動を理解することができ、骨細胞と疾患の状況におけるその機能を特徴付けることができます。