Unterschiede in der Knochenzellaktivität zwischen rheumatoider Arthritis und ankylosierender Spondylitis

Ziele:

1. Bewerten Sie den Einfluss von Zellen des Immunsystems auf die Modulation des Knochenumsatzes bei Patienten mit RA, AS und gesunden Spendern (Aufgabe 2).
2. Analysieren Sie die Osteoklasten-Vorläufer und ihre Differenzierung zu voll funktionsfähigen Osteoklasten in einer Untergruppe von Patienten mit RA, AS und gesunden Spendern (Aufgabe 3, 4 und 6).
3. Untersuchung des Differenzierungspotentials und der Aktivität von Osteoblasten in einer Untergruppe von Patienten mit RA und AS (Aufgabe 5 und 6)
4. Bewerten Sie die Wirkung der Therapie auf die Knochenzelldifferenzierung und -funktion in einer Untergruppe von Patienten mit RA und AS, die mit TNF-Blockern behandelt wurden (Aufgabe 2, 3, 4 und 5).

Arbeitsprogramm und Zeitplan Beginn: Juli 2011. Abschlussdatum: Juli 2013 Aufgabe 1 – Patienten Patienten mit RA-Diagnose (gemäß den überarbeiteten Kriterien der American Rheumatism Association, 1988) und AS-Diagnose (gemäß den Kriterien der European Spondyloarthropathy Study Group, 1991), die in den Bereichen Rheumatologie und Knochen- und Stoffwechselerkrankungen weiterverfolgt wurden Die Abteilung des Hospital de Santa Maria (HSM) wird für diese Studie rekrutiert. 25 Patienten mit aktiver RA (Disease Activity Score 28 (DAS28) > 3,2) und 25 Patienten mit aktiver AS (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) > 4) werden in die Studie aufgenommen. Fünfzehn gesunde Spender gleichen Geschlechts und Alters werden rekrutiert und als Kontrollgruppe verwendet.

Die Patienten werden einem klinischen Protokoll unterzogen, das Informationen zu Geschlecht, Alter, Krankheitsdauer, früheren Therapien, Vorhandensein von Rheumafaktor- und antizyklisch-citrullinierten Peptid-Antikörpern, Human Leukocyte Antigen (HLA)-B27-Status, DAS28-Score und Gesundheitsbewertungsfragebogen enthält - HAQ (Health Assessment Questionnaire, für RA-Patienten), BASDAI, Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index - BASFI (für AS-Patienten) und Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS). Vor Beginn der Behandlung mit Glukokortikoiden und krankheitsmodifizierenden Antirheumatika (DMARDs: Methotrexat, Sulfasalazin und Leflunomid) und 3 Monate nach Erreichen einer stabilen Dosis dieser Medikamente wird den Patienten Blut entnommen. Für diejenigen, die mit TNF-Blockern beginnen, werden nach 6 Monaten nach Beginn der Therapie Blutproben entnommen. Da erwartet wird, dass nur eine Minderheit dieser ersten Kohorte mit TNF-Antagonisten behandelt werden muss, wird eine zweite Gruppe von 25 RA- und 25 AS-Patienten, die für den Start mit TNF-Antagonisten ausgewählt wurden, vor Beginn des Medikaments und 6 Monate später untersucht.

Vor jedem protokollspezifischen Verfahren wird von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung nach Aufklärung eingeholt, und diese Studie wird in Übereinstimmung mit den Vorschriften für klinische Studien wie der Deklaration von Helsinki in der in Tokio (2004) geänderten Fassung durchgeführt. Diese Studie wurde von der HSM-Ethikkommission genehmigt.

Alle Verfahren in den folgenden Aufgaben werden an RA- und AS-Patienten (Serum und Blut) und gesunden Spendern (Serum) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

Aufgabe 2 – Untersuchung der Entzündungsreize und Knochenumsatzmarker Subpopulationen von Immunsystemzellen (Neutrophile, B- und T-Zell-Subpopulationen, einschließlich Th17-Zellen) werden mittels Durchflusszytometrie auf Oberflächen-RANKL-Expression analysiert.

Proinflammatorische Zytokine wie IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF und knochenmodulierende Proteine ​​(OPG, sRANKL, Sclerostin und Dickkopf-1) werden mittels ELISA quantifiziert. Knochenabbauenzyme wie die tartratresistente saure Phosphatase (TRAP)5b und Knochenumsatzmarker wie Typ-I-Kollagen, carboxyterminal vernetztes Telopeptid (ICTP) und Prokollagen, Typ-1-Amino-terminales Propeptid (P1NP) werden ebenfalls untersucht.

Die aus Durchflusszytometrie-Experimenten und Proteinquantifizierung gewonnenen Daten werden zwischen Krankheiten vor und nach der Behandlung und mit gesunden Spendern verglichen. Dies wird es uns ermöglichen, die krankheitsspezifischen Unterschiede in der systemischen und lokalen Entzündungsumgebung bei unbehandelten Patienten und die Wirkung der verschiedenen Therapien in derselben Umgebung zu verstehen.

Aufgabe 3 – Analyse von Osteoklasten-Vorläufern und deren Differenzierung zu funktionellen Osteoklasten Zirkulierende CD14+-Zellen werden durch die Analyse von Markern wie HLA-DR, Differenzierungscluster (CD)16, CD86, CD11b und CD62L sowie Osteoklasten-Differenzierungs-assoziierten Proteinen charakterisiert. wie das Oberflächenintegrin CD51/CD61 (αVβ3-Integrin), RANK (Rezeptoraktivator von nf-kappa-beta) und der Calcitonin-Rezeptor durch Durchflusszytometrie.

Um die Osteoklasten-Vorläufer vollständig zu charakterisieren, wird die Expression von Osteoklasten-verwandten Genen wie DC-STAMP, MITF (Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor), CTSK (Kathepsin K), TRACP und ATP6v0d2 in CD14+-Zellen durch quantitative Polymerase in Echtzeit bewertet Kettenreaktion (RT-qPCR). Die erhaltenen Ergebnisse werden mit den Haushaltsgenen Beta-Glucuronidase (GUSB) und Phosphomannomutase-1 (PMM1) normalisiert.

Daten aus Durchflusszytometrie und Genexpressionsexperimenten werden zwischen behandelten und unbehandelten Patienten und gesunden Spendern verglichen. Diese Aufgabe wird uns quantitative Informationen über die krankheitsspezifischen Veränderungen der CD14+ Monozyten-Subpopulation liefern und es uns ermöglichen, die Wirkung der Therapie in den zirkulierenden Vorläuferzellen zu verstehen.

Aufgabe 4 – Funktion und Zelldynamik der differenzierten Osteoklasten Die isolierten CD14+-Monozyten werden 21 Tage lang in Gegenwart von M-CSF (Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und hrRANKL (humaner rekombinanter Rezeptoraktivator des nf-kappa-Beta-Liganden) bei 37º kultiviert , 5 % CO2 in Multiwell-Kulturplatten.

Osteoklasten werden an den Tagen 7, 14 und 21 der Kultur analysiert, um die Zelldynamik zu beurteilen. Die Expression osteoklastenspezifischer Gene wird zu diesen Zeitpunkten mittels RT-qPCR analysiert (siehe Aufgabe 3). Eine durchflusszytometrische Analyse wird durchgeführt, um die CD51/CD61- und RANK-Oberflächenexpression zu beurteilen. Daten, die während der Zeitpunkte (Tage 7, 14 und 21) von Patienten und gesunden Kontrollen erhalten wurden, werden mit den gleichen Daten verglichen, die von den Vorläuferzellen erhalten wurden.

Am 21. Kulturtag werden die Zellen in zwei funktionellen Assays verwendet: TRAP-Färbung und Resorptionsassay. Im TRAP-Färbungsassay werden wir die Anzahl der in Kultur gebildeten Osteoklasten durch Zählen von TRAP-positiven mehrkernigen Zellen mit mehr als 3 Kernen (Osteoklasten) bestimmen. Der Vergleich dieses Werts mit der Kernzahl in CD14+-Monozyten in Kulturplatten wird es uns ermöglichen, den Fusionsindex dieser Vorläufer zu bestimmen. Der Resorptionsassay wird durch Kultivierung von Monozyten über Knochenscheiben durchgeführt und erlaubt uns, die Resorptionsaktivität von funktionellen Osteoklasten zu messen. Dies wird durch Bildanalyse der mit Toluidinblau gefärbten Knochenscheiben gemessen, wo der resorbierte Bereich eine blaue bis violette Farbe annimmt. Die Analyse der Fusionsrate von Vorläufern und des von Osteoklasten resorbierten Bereichs wird es uns ermöglichen, Unterschiede in der Osteoklastenfunktion zwischen RA- und AS-Patienten und gesunden Spendern zu identifizieren.

Sowohl Monozyten als auch Osteoklasten werden hinsichtlich der RANK/RANKL- und der αVβ3-Integrin- und c-fms-Signalwege untersucht, die zur Rekrutierung und Aktivierung von TRAF6, Tyrosinkinase Src und extrazellulärer signalregulierter Kinase (ERK)1/2 führen, die NF- aktivieren. kB und andere Transkriptionsfaktoren. Diese Signalwege werden unter Verwendung der Luminex xMAP-Plattform mit EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore) untersucht. Ein Vergleich der Ergebnisse von unbehandelten Patienten und Kontrollpatienten wird es uns ermöglichen zu verstehen, ob es eine Beeinträchtigung der klassischen Osteoklasten-Differenzierungs-/Aktivierungswege bei AS im Vergleich zu RA gibt.

Die von behandelten und unbehandelten Patienten erhaltenen Ergebnisse werden einen Einblick in die Wirkung der Therapien auf Osteoklastendifferenzierung und -funktion geben. Der Vergleich der Gesamtergebnisse von unbehandelten Patienten und gesunden Spendern wird es uns ermöglichen, die wichtigsten Unterschiede zwischen Osteoklasten-Differenzierung und -Aktivierung bei diesen Pathologien zu verstehen.

Aufgabe 5 – Funktion und zelluläre Dynamik von Osteoblasten In einer Untergruppe von RA- und AS-Patienten, die entweder einem Hüftersatz oder einer zervikalen Operation unterzogen wurden, wird die Differenzierung von Osteoblasten untersucht. Unmittelbar nach der Operation wird ein kleines Stück Trabekelknochen (1 cm3) aus der Probe entnommen, um die Osteoblasten zu isolieren. Nach der Isolierung werden die Osteoblasten in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), ergänzt mit Vitamin D3 (10-8 M), kultiviert und die Zellen werden bei 80 % Konfluenz untersucht. Die Funktion der Osteoblasten wird in vitro mittels Methylthiazol-Tetrazolium (MTT)-Assay (Zellproliferation), Färbung mit alkalischer Phosphatase und Bildung von Mineralisierungsknötchen untersucht. Die Zellen werden auch für die RNA-Extraktion und Genexpressionsanalyse verwendet. Spezifische Gene, die für Proteine ​​wie Osteopontin, Kollagen Typ I, Osteocalcin, alkalische Phosphatase, RANKL, Osteoprotegerin, Runx2 und Osterix kodieren, werden analysiert, um die isolierten Zellen zu charakterisieren. Diese Ergebnisse werden es uns ermöglichen, die Unterschiede in der Differenzierung und Aktivität von Osteoblasten zwischen Krankheiten zu verstehen.

Aufgabe 6 – Knochen-Genexpressions-Assays In einer Untergruppe von RA- und AS-Patienten, die entweder einem Hüftersatz oder einer zervikalen Operation unterzogen wurden, werden wir Knochenproben bei -80 °C einfrieren. Während der Knochen noch gefroren ist, wird eine kleine Probe des trabekulären Knochens in einer kryogenen Mühle zu feinem Pulver zerkleinert und die RNA-Extraktion wird mit TRIzol-Reagenz durchgeführt. Die resultierende RNA wird auf ihre Integrität untersucht und in einem Bioanalyser quantifiziert. Daher ist die extrahierte RNA die Gesamtheit der im Knochen vorhandenen RNA aus Blut, Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten, Adipozyten und Knochenmarkszellen.

Die Genexpression sowohl in der Knochenmikroumgebung als auch in den Zellen aus den In-vitro-Studien wird mittels RT-PCR evaluiert. Spezifische Gene, die Proteine ​​sowohl von Osteoblasten als auch Osteoklasten codieren, wie Osteopontin, Kollagen Typ I, Osteocalcin, alkalische Phosphatase, RANKL, Osteoprotegerin, Runx2, Osterix, Cathepsin K, Beta3-Integrin-Untereinheit, Calcitonin-Rezeptor, ATPase-Untereinheit d2, TRAF6, RANK, TRAP werden unter anderem die Co-Rezeptoren OSCAR und TREM-2 untersucht. Die Aktivität der Osteozyten wird auch anhand der Expression spezifischer Gene, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11-Antigen, MEPE und CD44, bewertet. Auch die Gene, die die Entzündungszytokine IL-1, IL-6, IL-17 und TNF kodieren, werden untersucht.

Um die PCR-Effizienz zu beurteilen, werden Standardkurven aus RNA erstellt, die aus gefrorenen Knochenproben von Personen mit normaler Knochenmineraldichte und ohne andere Krankheit, die den Knochenstoffwechsel beeinflussen könnte, extrahiert wurde. Die Osteoklasten-, Osteoblasten- und Osteozytengene von Interesse werden durch das Standardkurvenverfahren quantifiziert.

Die RNA-Expressionsstudie an den Knochenproben wird es uns ermöglichen, die lokale Zellaktivität zu verstehen und Knochenzellen und ihre Funktion im Krankheitskontext zu charakterisieren.