Différences d'activité des cellules osseuses entre la polyarthrite rhumatoïde et la spondylarthrite ankylosante

Objectifs:

1. Évaluer l'influence des cellules du système immunitaire dans la modulation du renouvellement osseux chez les patients atteints de PR, de SA et de donneurs sains (Tâche 2).
2. Analyser les précurseurs des ostéoclastes et leur différenciation en ostéoclastes entièrement fonctionnels dans un sous-groupe de patients atteints de PR, de SA et de donneurs sains (Tâche 3, 4 et 6).
3. Étudier le potentiel et l'activité de différenciation des ostéoblastes dans un sous-groupe de patients atteints de PR et de SA (tâches 5 et 6)
4. Évaluer l'effet de la thérapie sur la différenciation et la fonction des cellules osseuses dans un sous-groupe de patients atteints de PR et de SA traités avec des anti-TNF (Tâches 2, 3, 4 et 5).

Programme de travail et calendrier Date de début : juillet 2011. Date de fin : juillet 2013 Le département de l'hôpital de Santa Maria (HSM) sera recruté pour cette étude. Vingt-cinq patients atteints de PR active (Disease Activity Score 28 (DAS28) > 3,2) et 25 patients atteints de SA active (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) > 4) seront inclus dans l'étude. Quinze donneurs sains, de sexe et d'âge appariés, seront recrutés et utilisés comme groupe témoin.

Les patients seront soumis à un protocole clinique qui comprend des informations sur le sexe, l'âge, la durée de la maladie, les traitements antérieurs, la présence d'anticorps anti-peptide rhumatoïde et anti-peptide citrulliné cyclique, le statut de l'antigène leucocytaire humain (HLA)-B27, le score DAS28 et le questionnaire d'évaluation de la santé. - HAQ (Health Assessment Questionnaire, pour les patients atteints de PR), BASDAI, Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index - BASFI (pour les patients SA) et Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS). Le sang des patients sera prélevé avant le début du traitement par les glucocorticoïdes et les antirhumatismaux modificateurs de la maladie (DMARD : méthotrexate, sulfasalazine et léflunomide) et 3 mois après avoir atteint une dose stable de ces médicaments. Pour ceux qui commencent à prendre des anti-TNF, des échantillons de sang seront prélevés après 6 mois de traitement initial. Parce qu'il est prévu que seule une minorité de cette cohorte initiale devra être traitée avec des anti-TNF, un deuxième groupe de 25 patients PR et 25 patients AS, sélectionnés pour commencer les anti-TNF, sera évalué avant de commencer le médicament et 6 mois plus tard.

Un consentement éclairé écrit sera obtenu de tous les patients avant toute procédure spécifique au protocole et cette étude sera menée conformément aux réglementations régissant les essais cliniques telles que la Déclaration d'Helsinki, telle que modifiée à Tokyo (2004). Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de HSM.

Toutes les procédures des tâches suivantes seront effectuées chez des patients PR et AS (sérum et sang) et des donneurs sains (sérum), sauf indication contraire.

Tâche 2 - Étude des stimuli inflammatoires et des marqueurs du remodelage osseux Des sous-populations de cellules du système immunitaire (neutrophiles, sous-populations de cellules B et T, y compris les cellules Th17) seront analysées pour l'expression de RANKL de surface par cytométrie en flux.

Les cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-1β, l'IL-6, l'IL-17A, l'IL-20, l'IL-23, le TNF et les protéines de modulation osseuse (OPG, sRANKL, sclérostine et dickkopf-1) seront quantifiées par ELISA. Les enzymes de dégradation osseuse comme la phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP)5b et les marqueurs du remodelage osseux comme le télopeptide réticulé carboxyterminal du collagène de type I (ICTP) et le propeptide amino-terminal du procollagène de type 1 (P1NP) seront également étudiés.

Les données obtenues à partir d'expériences de cytométrie en flux et de quantification de protéines seront comparées entre les maladies avant et après traitement et avec des donneurs sains. Cela nous permettra de comprendre les différences spécifiques à la maladie dans l'environnement inflammatoire systémique et local chez les patients non traités et l'effet des différentes thérapies sur ce même environnement.

Tâche 3 - Analyse des précurseurs d'ostéoclastes et de leur différenciation en ostéoclastes fonctionnels Les cellules CD14+ circulantes seront caractérisées par l'analyse de marqueurs tels que HLA-DR, cluster de différenciation (CD)16, CD86, CD11b et CD62L, ainsi que les protéines associées à la différenciation des ostéoclastes, comme l'intégrine de surface CD51/CD61 (intégrine αVβ3), RANK (activateur du récepteur de la nf-kappa beta) et le récepteur de la calcitonine par cytométrie en flux.

Afin de caractériser pleinement les précurseurs des ostéoclastes, l'expression de gènes liés aux ostéoclastes tels que DC-STAMP, MITF (facteur de transcription associé à la microphtalmie), CTSK (cathepsine K), TRACP et ATP6v0d2 dans les cellules CD14+ sera évaluée par polymérase quantitative en temps réel réaction en chaîne (RT-qPCR). Les résultats obtenus seront normalisés avec les gènes domestiques beta glucuronidase (GUSB) et phosphomannomutase-1 (PMM1).

Les données obtenues à partir d'expériences de cytométrie en flux et d'expression génique seront comparées entre patients traités et non traités et avec des donneurs sains. Cette tâche nous fournira des informations quantitatives sur les changements spécifiques à la maladie de la sous-population de monocytes CD14+ et nous permettra de comprendre l'effet de la thérapie dans les cellules précurseurs en circulation.

Tâche 4 - Fonction et dynamique cellulaire des ostéoclastes différenciés Les monocytes CD14+ isolés seront cultivés pendant 21 jours en présence de M-CSF (facteur de stimulation des colonies de macrophages) et hrRANKL (activateur du récepteur recombinant humain du ligand bêta nf-kappa) à 37º , 5% CO2 dans des plaques de culture multipuits.

Les ostéoclastes seront analysés aux jours 7, 14 et 21 de culture pour évaluer la dynamique cellulaire. L'expression des gènes spécifiques aux ostéoclastes sera analysée à ces moments-là par RT-qPCR (voir tâche 3). Une analyse par cytométrie en flux sera effectuée pour évaluer l'expression de surface CD51/CD61 et RANK. Les données obtenues pendant les points temporels (jours 7, 14 et 21) des patients et des témoins sains seront comparées aux mêmes données obtenues à partir des cellules précurseurs.

Au 21ème jour de culture, les cellules seront utilisées dans deux tests fonctionnels : coloration TRAP et test de résorption. Dans le test de coloration TRAP, nous évaluerons le nombre d'ostéoclastes formés en culture en comptant les cellules multinucléées TRAP-positives avec plus de 3 noyaux (ostéoclastes). La comparaison de cette valeur avec le nombre de noyaux dans les monocytes CD14+ dans des plaques de culture nous permettra de déterminer l'indice de fusion de ces précurseurs. Le test de résorption est réalisé en cultivant des monocytes sur des tranches osseuses et permet de mesurer l'activité de résorption des ostéoclastes fonctionnels. Cela sera mesuré par analyse d'image des tranches d'os colorées au bleu de toluidine où la zone résorbée acquiert une couleur bleue à violette. L'analyse du taux de fusion des précurseurs et de la zone de résorption des ostéoclastes permettra d'identifier les différences de fonction des ostéoclastes entre les patients PR et SA et les donneurs sains.

Les monocytes et les ostéoclastes seront étudiés en ce qui concerne le RANK/RANKL et les voies de signalisation de l'intégrine αVβ3 et c-fms qui conduisent au recrutement et à l'activation de TRAF6, de la tyrosine kinase Src et de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK)1/2 activant NF- kB et d'autres facteurs de transcription. Ces voies de signalisation seront étudiées à l'aide de la plateforme Luminex xMAP avec EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). La comparaison des résultats des patients non traités et des témoins nous permettra de comprendre s'il existe une altération des voies classiques de différenciation/activation des ostéoclastes dans la SA par rapport à la PR.

Les résultats obtenus à partir de patients traités et non traités donneront un aperçu de l'action des thérapies sur la différenciation et la fonction des ostéoclastes. La comparaison des résultats globaux de patients non traités et de donneurs sains nous permettra de comprendre les principales différences entre la différenciation et l'activation des ostéoclastes dans ces pathologies.

Tâche 5 - Fonction et dynamique cellulaire des ostéoblastes Dans un sous-groupe de patients atteints de PR et de SA soumis soit à une arthroplastie de la hanche, soit à une chirurgie cervicale, la différenciation des ostéoblastes sera étudiée. Immédiatement après la chirurgie, un petit morceau d'os trabéculaire (1cm3) sera extrait de l'échantillon afin d'isoler les ostéoblastes. Après isolement, les ostéoblastes seront cultivés dans du milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté en vitamine D3 (10-8M) et les cellules seront étudiées à 80% de confluence. La fonction des ostéoblastes sera étudiée in vitro par dosage au méthylthiazole tétrazolium (MTT) (prolifération cellulaire), coloration à la phosphatase alcaline et formation de nodules de minéralisation. Les cellules seront également utilisées pour l'extraction d'ARN et l'analyse de l'expression génique. Des gènes spécifiques qui codent pour des protéines telles que l'ostéopontine, le collagène de type I, l'ostéocalcine, la phosphatase alcaline, RANKL, l'ostéoprotégérine, runx2 et osterix seront analysés pour caractériser les cellules isolées. Ces résultats nous permettront de comprendre les différences de différenciation et d'activité des ostéoblastes entre les maladies.

Tâche 6 - Tests d'expression génique osseuse Dans un sous-groupe de patients atteints de PR et de SA soumis à une arthroplastie de la hanche ou à une chirurgie cervicale, nous congelerons des échantillons d'os à -80 °C. Avec l'os encore congelé, un petit échantillon d'os trabéculaire sera réduit en poudre fine dans un broyeur cryogénique et l'extraction de l'ARN sera réalisée à l'aide du réactif TRIzol. L'ARN résultant sera évalué pour son intégrité et quantifié dans un bioanalyseur. Par conséquent, l'ARN extrait sera le total des ARN présents dans l'os, provenant du sang, des ostéoblastes, des ostéoclastes, des ostéocytes, des adipocytes et des cellules de la moelle osseuse.

L'expression des gènes à la fois dans le microenvironnement osseux et dans les cellules issues des études in vitro sera évaluée par RT-PCR. Gènes spécifiques qui codent pour les protéines des ostéoblastes et des ostéoclastes tels que l'ostéopontine, le collagène de type I, l'ostéocalcine, la phosphatase alcaline, RANKL, l'ostéoprotégérine, runx2, osterix, la cathepsine K, la sous-unité de l'intégrine bêta3, le récepteur de la calcitonine, la sous-unité ATPase d2, TRAF6, RANK, TRAP , les co-récepteurs OSCAR et TREM-2, entre autres, seront étudiés. L'activité des ostéocytes sera également évaluée par l'expression de gènes spécifiques, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, antigène E11, MEPE et CD44. Les gènes qui codent les cytokines inflammatoires IL-1, IL-6, IL-17 et TNF seront également étudiés.

Afin d'évaluer l'efficacité de la PCR, des courbes standard seront construites à partir d'ARN extrait d'échantillons osseux congelés d'individus ayant une densité minérale osseuse normale et sans autre maladie pouvant avoir une influence sur le métabolisme osseux. Les gènes d'intérêt des ostéoclastes, ostéoblastes et ostéocytes seront quantifiés par la méthode de la courbe standard.

L'étude de l'expression de l'ARN sur les échantillons osseux permettra de comprendre l'activité cellulaire locale et de caractériser les cellules osseuses et leur fonction dans un contexte pathologique.