Erot luusolujen aktiivisuudessa nivelreuman ja selkärankareuman välillä

Tavoitteet:

1. Arvioi immuunijärjestelmän solujen vaikutusta luun vaihtuvuuden modulaatioon potilailla, joilla on nivelreuma, AS ja terveitä luovuttajia (tehtävä 2).
2. Analysoi osteoklastien esiasteita ja niiden erilaistumista täysin toimiviksi osteoklasteiksi nivelreumaa, AS:ta ja terveitä luovuttajia sairastavien potilaiden alaryhmässä (tehtävät 3, 4 ja 6).
3. Tutki osteoblastien erilaistumispotentiaalia ja aktiivisuutta nivelreumaa ja AS:ta sairastavien potilaiden alaryhmässä (tehtävät 5 ja 6)
4. Arvioi hoidon vaikutus luusolujen erilaistumiseen ja toimintaan TNF-salpaajilla hoidettujen nivelreuma- ja selkärankareumapotilaiden alaryhmässä (tehtävät 2, 3, 4 ja 5).

Työohjelma ja aikataulu Aloituspäivä: heinäkuu 2011. Päättymispäivä: heinäkuu 2013 Tehtävä 1 - Potilaat Potilaat, joilla on nivelreumadiagnoosi (tarkistettujen American Rheumatism Associationin kriteerien mukaan, 1988) ja AS-diagnoosi (European Spondyloarthropathy Study Groupin kriteerien mukaan, 1991), seurattiin Rheumatology and Bone and Metabolic -osastolla. Santa Marian sairaalan osasto (HSM) rekrytoidaan tähän tutkimukseen. Tutkimukseen otetaan mukaan 25 potilasta, joilla on aktiivinen nivelreuma (Disease Activity Score 28 (DAS28) > 3,2) ja 25 potilasta, joilla on aktiivinen AS (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) > 4). Viisitoista tervettä luovuttajaa, sukupuolen ja iän mukaan, rekrytoidaan ja käytetään kontrolliryhmänä.

Potilaille lähetetään kliininen protokolla, joka sisältää tiedot sukupuolesta, iästä, sairauden kestosta, aiemmista hoidoista, reumatekijän ja antisyklisten sitrullinoitujen peptidien vasta-aineista, ihmisen leukosyyttiantigeenin (HLA)-B27-statuksesta, DAS28-pisteistä ja terveysarvioinnista. - HAQ (Health Assessment Questionnaire, RA-potilaille), BASDAI, Maastrichtin selkärankareuma-enteesipistemäärä (MASES), kylpyselkärankareuman toiminnallinen indeksi - BASFI (AS-potilaille) ja selkärankareumataudin aktiivisuuspisteet (ASDAS). Potilailta kerätään verta ennen glukokortikoidihoidon ja sairautta modifioivien reumalääkkeiden (DMARD:t: metotreksaatti, sulfasalatsiini ja leflunomidi) aloittamista ja 3 kuukautta näiden lääkkeiden vakaan annoksen saavuttamisen jälkeen. Niiltä, ​​jotka aloittavat TNF-salpaajan, verinäytteet otetaan 6 kuukauden kuluttua hoidon aloittamisesta. Koska on odotettavissa, että vain pieni osa tästä alkuperäisestä kohortista on hoidettava TNF-antagonisteilla, toinen ryhmä 25 RA- ja 25 AS-potilasta, jotka valitaan aloittamaan TNF-antagonistit, arvioidaan ennen lääkkeen aloittamista ja 6 kuukautta myöhemmin.

Kaikilta potilailta hankitaan kirjallinen tietoinen suostumus ennen protokollakohtaisia ​​toimenpiteitä, ja tämä tutkimus suoritetaan kliinisiä tutkimuksia koskevien määräysten, kuten Helsingin julistuksen, sellaisena kuin se on muutettuna Tokiossa (2004), mukaisesti. Tämän tutkimuksen hyväksyi HSM:n eettinen komitea.

Kaikki seuraavien tehtävien toimenpiteet suoritetaan nivelreuma- ja AS-potilaille (seerumi ja veri) ja terveille luovuttajille (seerumi), ellei toisin mainita.

Tehtävä 2 - Inflammatoristen ärsykkeiden ja luun vaihtumismarkkereiden tutkimus Immuunijärjestelmän solujen alapopulaatioita (neutrofiilit, B- ja T-solualapopulaatiot, mukaan lukien Th17-solut) analysoidaan pinta-RANKL-ilmentymisen suhteen virtaussytometrillä.

Tulehdusta edistävät sytokiinit, kuten IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF ja luuta moduloivat proteiinit (OPG, sRANKL, sklerostiini ja dickkopf-1), kvantifioidaan ELISA:lla. Lisäksi tutkitaan luun hajoamisentsyymejä, kuten tartraattiresistenttiä hapan fosfataasi (TRAP)5b ja luun vaihtuvuuden markkereita, kuten tyypin I kollageenin karboksiterminaalista ristisilloitettua telopeptidiä (ICTP) ja prokollageenin tyypin 1 aminoterminaalista propeptidiä (P1NP).

Virtaussytometriakokeista ja proteiinien kvantifioinnista saatuja tietoja verrataan sairauksien välillä ennen hoitoa ja sen jälkeen sekä terveiden luovuttajien kanssa. Tämä antaa meille mahdollisuuden ymmärtää sairauskohtaisia ​​eroja systeemisessä ja paikallisessa tulehdusympäristössä hoitamattomilla potilailla ja eri hoitojen vaikutusta tähän samaan ympäristöön.

Tehtävä 3 - Osteoklastien esiasteiden analyysi ja niiden erilaistuminen toiminnallisiksi osteoklasteiksi Verenkierrossa olevat CD14+-solut karakterisoidaan analysoimalla markkereita, kuten HLA-DR, erilaistumisklusteri (CD)16, CD86, CD11b ja CD62L sekä osteoklastien erilaistumiseen liittyviä proteiineja, kuten pinta-integriini CD51/CD61 (αVp3-integriini), RANK (nf-kappa-beetan reseptoriaktivaattori) ja kalsitoniinireseptori virtaussytometrialla.

Osteoklastien esiasteiden täydelliseksi karakterisoimiseksi osteoklasteihin liittyvien geenien, kuten DC-STAMP, MITF (mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä), CTSK (katepsiini K), TRACP ja ATP6v0d2, ilmentyminen CD14+-soluissa arvioidaan reaaliaikaisella kvantitatiivisella polymeraasilla. ketjureaktio (RT-qPCR). Saadut tulokset normalisoidaan taloudenhoitogeeneillä beeta-glukuronidaasi (GUSB) ja fosfomannomutase-1 (PMM1).

Virtaussytometria- ja geeniekspressiokokeista saatuja tietoja verrataan hoidettujen ja hoitamattomien potilaiden sekä terveiden luovuttajien välillä. Tämä tehtävä antaa meille kvantitatiivista tietoa CD14+-monosyyttien alapopulaation sairauskohtaisista muutoksista ja antaa meille mahdollisuuden ymmärtää hoidon vaikutusta kiertäviin esiastesoluihin.

Tehtävä 4 - Erilaistuneiden osteoklastien toiminta ja soludynamiikka Eristettyjä CD14+-monosyyttejä viljellään 21 vuorokautta M-CSF:n (makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä) ja hrRANKL:n (ihmisen nf-kappa beetaligandin rekombinanttireseptoriaktivaattori) läsnä ollessa 37º:ssa. , 5 % CO2 monikuoppaisilla viljelylevyillä.

Osteoklastit analysoidaan viljelypäivinä 7, 14 ja 21 soludynamiikan arvioimiseksi. Osteoklasteille spesifisten geenien ilmentyminen analysoidaan näissä aikapisteissä RT-qPCR:llä (katso tehtävä 3). Virtaussytometria-analyysi suoritetaan CD51/CD61- ja RANK-pinnan ilmentymisen arvioimiseksi. Potilailta ja terveiltä kontrolleilta ajankohtina (päivät 7, 14 ja 21) saatuja tietoja verrataan samoihin tietoihin, jotka on saatu esiastesoluista.

21. viljelypäivänä soluja käytetään kahdessa toiminnallisessa määrityksessä: TRAP-värjäys- ja resorptiomäärityksessä. TRAP-värjäysmäärityksessä arvioimme viljelmässä muodostuneiden osteoklastien lukumäärän laskemalla TRAP-positiiviset monitumaiset solut, joissa on yli 3 tumaa (osteoklastit). Tämän arvon vertailu CD14+-monosyyttien tumamäärään viljelylevyillä antaa meille mahdollisuuden määrittää näiden esiasteiden fuusioindeksi. Resorptiomääritys suoritetaan viljelemällä monosyyttejä luuviipaleiden päällä, ja sen avulla voimme mitata toiminnallisten osteoklastien resorptioaktiivisuutta. Tämä mitataan kuva-analyysillä toluidiinisinisellä värjätyistä luuviipaleista, joissa resorboitunut alue saa värin sinisestä purppuraan. Prekursorien fuusionopeuden ja osteoklastien resorboituneen alueen analyysi antaa meille mahdollisuuden tunnistaa erot osteoklastien toiminnassa RA- ja AS-potilaiden ja terveiden luovuttajien välillä.

Sekä monosyyttejä että osteoklasteja tutkitaan koskien RANK/RANKL- ja αVβ3-integriini- ja c-fms-signalointireittejä, jotka johtavat TRAF6:n, tyrosiinikinaasin Src:n ja solunulkoisen signaalisäädellyn kinaasin (ERK)1/2 aktivoivan NF-aktivoitumiseen ja aktivoitumiseen. kB ja muut transkriptiotekijät. Näitä signalointireittejä tutkitaan käyttämällä Luminex xMAP -alustaa EpiQuant Cell Signaling Assaysin (Millipore) kanssa. Hoitamattomien potilaiden ja kontrollien tulosten vertailu antaa meille mahdollisuuden ymmärtää, onko osteoklastien erilaistumisen/aktivaation klassisissa reiteissä heikkenemistä AS:ssa verrattuna nivelreumaan.

Hoidetuista ja hoitamattomista potilaista saadut tulokset antavat käsityksen hoitojen vaikutuksesta osteoklastien erilaistumiseen ja toimintaan. Vertaamalla hoitamattomien potilaiden ja terveiden luovuttajien kokonaistuloksia voimme ymmärtää keskeisiä eroja osteoklastien erilaistumisen ja aktivoitumisen välillä näissä patologioissa.

Tehtävä 5 - Osteoblastien toiminta ja soludynamiikka Alaryhmässä nivelreuma- ja AS-potilaita, joille tehtiin joko lonkkaproteesi tai kohdunkaulan leikkaus, tutkitaan osteoblastien erilaistumista. Välittömästi leikkauksen jälkeen näytteestä uutetaan pieni pala trabekulaarista luuta (1 cm3) osteoblastien eristämiseksi. Eristyksen jälkeen osteoblasteja viljellään Dulbeccon minimaalisessa välttämättömässä alustassa (DMEM), jota on täydennetty D3-vitamiinilla (10-8M) ja soluja tutkitaan 80 %:n konfluenssissa. Osteoblastien toimintaa tutkitaan in vitro metyylitiatsolitetratsoliumilla (MTT) (soluproliferaatio), alkalisen fosfataasin värjäyksellä ja mineralisaatiokyhmyjen muodostuksella. Soluja käytetään myös RNA:n uuttamiseen ja geeniekspressioanalyysiin. Eristettyjen solujen karakterisoimiseksi analysoidaan spesifisiä proteiineja koodaavia geenejä, kuten osteopontiini, tyypin I kollageeni, osteokalsiini, alkalinen fosfataasi, RANKL, osteoprotegeriini, runx2 ja osterix. Näiden tulosten avulla voimme ymmärtää eroja osteoblastien erilaistumisessa ja aktiivisuudessa sairauksien välillä.

Tehtävä 6 - Luugeenin ilmentymismääritykset Alaryhmässä RA- ja AS-potilaita, joille tehtiin joko lonkkaproteesi tai kohdunkaulan leikkaus, jäädytämme luunäytteet -80 ºC:ssa. Luun ollessa vielä jäässä, pieni näyte trabekulaarisesta luusta pelkistetään hienoksi jauheeksi kryogeenisessä myllyssä ja RNA-uutto suoritetaan käyttämällä TRIzol-reagenssia. Tuloksena oleva RNA arvioidaan sen eheyden suhteen ja kvantifioidaan bioanalysaattorissa. Siksi uutettu RNA on luussa verestä, osteoblasteista, osteoklasteista, osteosyyteistä, rasvasoluista ja luuydinsoluista peräisin olevan RNA:n kokonaismäärä.

Geenien ilmentyminen sekä luun mikroympäristössä että soluissa in vitro -tutkimuksista arvioidaan RT-PCR:llä. Spesifiset geenit, jotka koodaavat proteiineja sekä osteoblasteista että osteoklasteista, kuten osteopontiini, kollageeni tyyppi I, osteokalsiini, alkalinen fosfataasi, RANKL, osteoprotegeriini, runx2, osterix, katepsiini K, beeta3-integriinialayksikkö, kalsitoniinireseptori, ATPaasi-alayksikkö d2TRAK, TRAP , tutkitaan muun muassa rinnakkaisreseptoreita OSCAR ja TREM-2. Osteosyyttien aktiivisuutta arvioidaan myös spesifisten geenien, SOST:n, Dkk1:n, DMP-1:n, Phexin, E11-antigeenin, MEPE:n ja CD44:n, ilmentymisen perusteella. Myös tulehduksellisia sytokiineja IL-1, IL-6, IL-17 ja TNF koodaavia geenejä tutkitaan.

PCR-tehokkuuden arvioimiseksi rakennetaan standardikäyrät RNA:sta, joka on uutettu jäädytetyistä luunäytteistä henkilöiltä, ​​joilla on normaali luutiheys ja joilla ei ole muita luun aineenvaihduntaan vaikuttavia sairauksia. Kiinnostavat osteoklasti-, osteoblasti- ja osteosyyttigeenit kvantifioidaan standardikäyrämenetelmällä.

Luunäytteiden RNA-ilmentymistutkimus antaa meille mahdollisuuden ymmärtää paikallista solutoimintaa ja luonnehtia luusoluja ja niiden toimintaa sairauden yhteydessä.