Verschillen in botcelactiviteit tussen reumatoïde artritis en spondylitis ankylopoetica

Doelstellingen:

1. Beoordeel de invloed van cellen van het immuunsysteem op de modulatie van botomzetting bij patiënten met RA, AS en gezonde donoren (taak 2).
2. Analyseer de osteoclastvoorlopers en hun differentiatie tot volledig functionele osteoclasten in een subgroep van patiënten met RA, AS en gezonde donoren (taak 3, 4 en 6).
3. Bestudeer het differentiatiepotentieel en de activiteit van osteoblasten in een subgroep van patiënten met RA en AS (taak 5 en 6)
4. Beoordeel het effect van de therapie op de botceldifferentiatie en -functie in een subgroep van patiënten met RA en AS die werden behandeld met TNF-blokkers (taak 2, 3, 4 en 5).

Werkprogramma en tijdschema Startdatum: juli 2011. Einddatum: juli 2013 Taak 1 - Patiënten Patiënten met RA-diagnose (volgens de herziene criteria van de American Rheumatism Association, 1988) en AS-diagnose (volgens de criteria van de European Spondyloarthropathy Study Group, 1991) werden opgevolgd in de Reumatology and Bone and Metabolic Diseases Afdeling van Hospital de Santa Maria (HSM) zal worden aangeworven voor deze studie. Vijfentwintig patiënten met actieve RA (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3,2) en 25 patiënten met actieve AS (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI)>4) zullen in het onderzoek worden opgenomen. Vijftien gezonde donoren, van geslacht en leeftijd, zullen worden geworven en als controlegroep worden gebruikt.

Patiënten zullen worden onderworpen aan een klinisch protocol dat informatie bevat over geslacht, leeftijd, ziekteduur, eerdere therapieën, aanwezigheid van reumafactor en anticyclische gecitrullineerde peptide-antilichamen, humaan leukocytenantigeen (HLA)-B27-status, DAS28-score en gezondheidsbeoordelingsvragenlijst - HAQ (Health Assessment Questionnaire, voor RA-patiënten), BASDAI, Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index - BASFI (voor AS-patiënten) en Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS). Er zal bloed worden afgenomen bij patiënten vóór aanvang van de behandeling met glucocorticoïden en ziektemodificerende antireumatische geneesmiddelen (DMARD's: methotrexaat, sulfasalazine en leflunomide) en 3 maanden na het bereiken van een stabiele dosis van deze geneesmiddelen. Voor degenen die als laatste beginnen met TNF-blokkers, zullen bloedmonsters worden verzameld na 6 maanden na het starten van de therapie. Omdat verwacht wordt dat slechts een minderheid van dit initiële cohort behandeld zal moeten worden met TNF-antagonisten, zal een tweede groep van 25 RA- en 25 AS-patiënten, geselecteerd voor het starten met TNF-antagonisten, worden beoordeeld voordat met het geneesmiddel wordt begonnen en 6 maanden later.

Schriftelijke geïnformeerde toestemming zal van alle patiënten worden verkregen voorafgaand aan een protocolspecifieke procedure en deze studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften voor klinische proeven, zoals de Verklaring van Helsinki, zoals gewijzigd in Tokio (2004). Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van HSM.

Alle procedures in de volgende taken worden uitgevoerd bij RA- en AS-patiënten (serum en bloed) en gezonde donoren (serum), tenzij anders vermeld.

Taak 2 - Studie van de ontstekingsstimuli en markers voor botomzetting Subpopulaties van cellen van het immuunsysteem (neutrofielen, subpopulaties van B- en T-cellen, inclusief Th17-cellen) zullen worden geanalyseerd op oppervlakte-RANKL-expressie door middel van flowcytometrie.

Pro-inflammatoire cytokines zoals IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF en botmodulerende eiwitten (OPG, sRANKL, sclerostin en dickkopf-1) zullen worden gekwantificeerd door ELISA. Botafbraakenzymen zoals tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP)5b en markers voor botomzetting zoals type I collageen carboxyterminaal verknoopt telopeptide (ICTP) en procollageen type 1 amino-terminaal propeptide (P1NP) zullen ook bestudeerd worden.

De gegevens verkregen uit flowcytometrie-experimenten en eiwitkwantificering zullen worden vergeleken tussen ziekten voor en na behandeling en met gezonde donoren. Dit zal ons in staat stellen de ziektespecifieke verschillen in de systemische en lokale ontstekingsomgeving bij onbehandelde patiënten en het effect van de verschillende therapieën op dezelfde omgeving te begrijpen.

Taak 3 - Analyse van osteoclastvoorlopers en hun differentiatie tot functionele osteoclasten Circulerende CD14+-cellen zullen worden gekarakteriseerd door analyse van merkers zoals HLA-DR, cluster van differentiatie (CD)16, CD86, CD11b en CD62L, evenals osteoclastdifferentiatie-geassocieerde eiwitten, zoals de oppervlakte-integrine CD51 / CD61 (αVβ3-integrine), RANK (receptoractivator van nf-kappa beta) en de calcitoninereceptor door flowcytometrie.

Om de voorlopers van osteoclasten volledig te karakteriseren, zal de expressie van osteoclast-gerelateerde genen zoals DC-STAMP, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), CTSK (cathepsin K), TRACP en ATP6v0d2 in CD14+-cellen worden beoordeeld door middel van realtime kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR). De verkregen resultaten zullen worden genormaliseerd met de huishoudgenen beta-glucuronidase (GUSB) en fosfomannomutase-1 (PMM1).

Gegevens verkregen uit flowcytometrie en genexpressie-experimenten zullen worden vergeleken tussen behandelde en onbehandelde patiënten en met gezonde donoren. Deze taak zal ons kwantitatieve informatie verschaffen over de ziektespecifieke veranderingen van de subpopulatie CD14+ monocyten en het zal ons in staat stellen het effect van therapie in de circulerende voorlopercellen te begrijpen.

Taak 4 - Functie en cellulaire dynamiek van de gedifferentieerde osteoclasten De geïsoleerde CD14+-monocyten zullen gedurende 21 dagen worden gekweekt in aanwezigheid van M-CSF (macrofaagkoloniestimulerende factor) en hrRANKL (menselijke recombinante receptoractivator van nf-kappa beta-ligand) bij 37º , 5% CO2 in kweekplaten met meerdere putjes.

Osteoclasten zullen worden geanalyseerd op dag 7, 14 en 21 van de kweek om de cellulaire dynamiek te beoordelen. Expressie van osteoclast-specifieke genen zal op deze tijdstippen worden geanalyseerd met RT-qPCR (zie Taak 3). Flowcytometrie-analyse zal worden uitgevoerd om de CD51/CD61- en RANK-oppervlakte-expressie te beoordelen. Gegevens verkregen op tijdstippen (dag 7, 14 en 21) van patiënten en gezonde controles zullen worden vergeleken met dezelfde gegevens verkregen van de voorlopercellen.

Op de 21e kweekdag zullen cellen worden gebruikt in twee functionele assays: TRAP-kleuring en resorptieassay. In de TRAP-kleuringstest zullen we het aantal osteoclasten gevormd in kweek bepalen door het tellen van TRAP-positieve meerkernige cellen met meer dan 3 kernen (osteoclasten). Door deze waarde te vergelijken met het aantal kernen in CD14+ monocyten in kweekplaten kunnen we de fusie-index van deze voorlopers bepalen. De resorptietest wordt uitgevoerd door monocyten te kweken over botplakjes en stelt ons in staat de resorptieactiviteit van functionele osteoclasten te meten. Dit wordt gemeten door middel van beeldanalyse van de botplakjes gekleurd met toluïdineblauw waarbij het geresorbeerde gebied een blauwe tot paarse kleur krijgt. De analyse van de fusiesnelheid van voorlopers en van het door osteoclast geresorbeerde gebied zal ons in staat stellen om verschillen in osteoclastfunctie tussen RA- en AS-patiënten en gezonde donoren te identificeren.

Zowel monocyten als osteoclasten zullen bestudeerd worden met betrekking tot de RANK/RANKL en de αVβ3 integrine en c-fms signaalroutes die leiden tot de rekrutering en activatie van TRAF6, tyrosinekinase Src en extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK)1/2 activerende NF- kB en andere transcriptiefactoren. Deze signaalroutes zullen worden bestudeerd met behulp van het Luminex xMAP-platform met EpiQuant Cell Signalling Assays (Millipore). Vergelijking van de resultaten van onbehandelde patiënten en controles zal ons in staat stellen te begrijpen of er een stoornis is in de osteoclastdifferentiatie/-activeringsroutes bij AS in vergelijking met RA.

De resultaten van behandelde en onbehandelde patiënten zullen inzicht geven in de werking van de therapieën op de osteoclastdifferentiatie en -functie. Door de algemene resultaten van onbehandelde patiënten en gezonde donoren te vergelijken, kunnen we de belangrijkste verschillen tussen osteoclastdifferentiatie en -activering bij deze pathologieën begrijpen.

Taak 5 - Functie en cellulaire dynamiek van osteoblasten In een subgroep van RA- en AS-patiënten die een heupvervanging of een cervicale operatie ondergingen, zal osteoblastdifferentiatie worden bestudeerd. Onmiddellijk na de operatie wordt een klein stukje trabeculair bot (1 cm3) uit het monster gehaald om de osteoblasten te isoleren. Na isolatie zullen osteoblasten worden gekweekt in Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) aangevuld met vitamine D3 (10-8M) en zullen cellen worden bestudeerd bij 80% confluentie. De functie van osteoblasten zal in vitro worden bestudeerd door middel van methylthiazooltetrazolium (MTT)-test (celproliferatie), alkalische fosfatasekleuring en vorming van mineralisatieknobbeltjes. Cellen zullen ook worden gebruikt voor RNA-extractie en analyse van genexpressie. Specifieke genen die coderen voor eiwitten zoals osteopontine, collageen type I, osteocalcine, alkalische fosfatase, RANKL, osteoprotegerine, runx2 en osterix zullen worden geanalyseerd om de geïsoleerde cellen te karakteriseren. Deze resultaten zullen ons in staat stellen de verschillen in osteoblastdifferentiatie en -activiteit tussen ziekten te begrijpen.

Taak 6 - Botgenexpressietests In een subgroep van RA- en AS-patiënten die een heupvervanging of een cervicale operatie ondergingen, zullen we botmonsters invriezen bij -80ºC. Terwijl het bot nog steeds bevroren is, wordt een klein stukje trabeculair bot verkleind tot fijn poeder in een cryogene molen en wordt de RNA-extractie uitgevoerd met behulp van TRIzol-reagens. Het resulterende RNA wordt beoordeeld op zijn integriteit en gekwantificeerd in een bioanalyser. Daarom zal het geëxtraheerde RNA het totale RNA zijn dat aanwezig is in bot, uit bloed, osteoblasten, osteoclasten, osteocyten, adipocyten en beenmergcellen.

De genexpressie zowel in de micro-omgeving van het bot als in de cellen van de in vitro studies zal geëvalueerd worden door middel van RT-PCR. Specifieke genen die coderen voor eiwitten van zowel osteoblasten als osteoclasten, zoals osteopontine, collageen type I, osteocalcine, alkalische fosfatase, RANKL, osteoprotegerine, runx2, osterix, cathepsine K, bèta3-integrinesubeenheid, calcitoninereceptor, ATPase-subeenheid d2, TRAF6, RANK, TRAP worden onder meer de co-receptoren OSCAR en TREM-2 bestudeerd. De activiteit van osteocyten zal ook worden beoordeeld door de expressie van specifieke genen, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11-antigeen, MEPE en CD44. Ook de genen die coderen voor de inflammatoire cytokines IL-1, IL-6, IL-17 en TNF zullen bestudeerd worden.

Om de PCR-efficiëntie te beoordelen, zullen standaardcurven worden opgebouwd uit RNA dat is geëxtraheerd uit bevroren botmonsters van personen met een normale botmineraaldichtheid en zonder andere ziekte die invloed zou kunnen hebben op het botmetabolisme. De van belang zijnde osteoclast-, osteoblast- en osteocytgenen zullen worden gekwantificeerd met behulp van de standaardcurvemethode.

De RNA-expressiestudie op de botmonsters zal ons in staat stellen de lokale celactiviteit te begrijpen en botcellen en hun functie in een ziektecontext te karakteriseren.