Diferencias en la actividad de las células óseas entre la artritis reumatoide y la espondilitis anquilosante

Objetivos:

1. Evaluar la influencia de las células del sistema inmunitario en la modulación del recambio óseo en pacientes con AR, EA y donantes sanos (Tarea 2).
2. Analizar los precursores de osteoclastos y su diferenciación en osteoclastos totalmente funcionales en un subgrupo de pacientes con AR, AS y donantes sanos (Tarea 3, 4 y 6).
3. Estudiar el potencial y la actividad de diferenciación de los osteoblastos en un subgrupo de pacientes con AR y AS (Tarea 5 y 6)
4. Evaluar el efecto de la terapia sobre la diferenciación y la función de las células óseas en un subgrupo de pacientes con AR y AS tratados con bloqueadores del TNF (tarea 2, 3, 4 y 5).

Programa y cronograma de trabajo Fecha de inicio: julio de 2011. Fecha de finalización: julio de 2013 Tarea 1 - Pacientes Pacientes con diagnóstico de AR (según los criterios revisados ​​de la American Rheumatism Association, 1988) y diagnóstico de EA (según los criterios del European Spondyloartropathy Study Group, 1991) en seguimiento en el Servicio de Reumatología y Enfermedades Óseas y Metabólicas Departamento del Hospital de Santa María (HSM) será reclutado para este estudio. Se incluirán en el estudio veinticinco pacientes con AR activa (puntuación de actividad de la enfermedad 28 (DAS28) > 3,2) y 25 pacientes con AS activa (índice de actividad de la enfermedad de la espondilitis anquilosante de Bath (BASDAI) > 4). Quince donantes sanos, del mismo sexo y edad, serán reclutados y utilizados como grupo de control.

Los pacientes serán sometidos a un protocolo clínico que incluye información sobre sexo, edad, duración de la enfermedad, terapias previas, presencia de factor reumatoide y anticuerpos antipéptido cíclico-citrulinado, estado del Antígeno Leucocitario Humano (HLA)-B27, puntaje DAS28 y Cuestionario de Evaluación de la Salud - HAQ (Cuestionario de evaluación de la salud, para pacientes con AR), BASDAI, Puntuación de entesitis por espondilitis anquilosante de Maastricht (MASES), Índice funcional de espondilitis anquilosante de Bath - BASFI (para pacientes con EA) y Puntuación de actividad de la enfermedad por espondilitis anquilosante (ASDAS). Se extraerá sangre de los pacientes antes de iniciar el tratamiento con glucocorticoides y fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FAME: metotrexato, sulfasalazina y leflunomida) y 3 meses después de alcanzar una dosis estable de estos fármacos. Para aquellos que comienzan a tomar bloqueadores del TNF más tarde, se recolectarán muestras de sangre después de 6 meses de comenzar la terapia. Debido a que se espera que solo una minoría de esta cohorte inicial necesite tratamiento con antagonistas del TNF, se evaluará un segundo grupo de 25 pacientes con AR y 25 con EA, seleccionados para comenzar con antagonistas del TNF, antes de comenzar con el fármaco y 6 meses después.

Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de cualquier procedimiento específico del protocolo y este estudio se realizará de acuerdo con las normas que rigen los ensayos clínicos, como la Declaración de Helsinki, modificada en Tokio (2004). Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de HSM.

Todos los procedimientos de las siguientes tareas se realizarán en pacientes con AR y SA (suero y sangre) y donantes sanos (suero), a menos que se indique lo contrario.

Tarea 2: estudio de los estímulos inflamatorios y los marcadores de recambio óseo Las subpoblaciones de células del sistema inmunitario (neutrófilos, subpoblaciones de células B y T, incluidas las células Th17) se analizarán para determinar la expresión de RANKL de superficie mediante citometría de flujo.

Las citoquinas proinflamatorias como IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF y proteínas moduladoras de hueso (OPG, sRANKL, sclerostin y dickkopf-1) serán cuantificadas por ELISA. También se estudiarán enzimas de degradación ósea como la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) 5b y marcadores de recambio óseo como el telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno tipo I (ICTP) y el propéptido amino-terminal de procolágeno tipo 1 (P1NP).

Los datos obtenidos de los experimentos de citometría de flujo y cuantificación de proteínas se compararán entre enfermedades antes y después del tratamiento y con donantes sanos. Esto nos permitirá comprender las diferencias específicas de la enfermedad en el entorno inflamatorio sistémico y local en pacientes no tratados y el efecto de las diferentes terapias sobre este mismo entorno.

Tarea 3 - Análisis de precursores de osteoclastos y su diferenciación en osteoclastos funcionales Las células CD14+ circulantes se caracterizarán mediante el análisis de marcadores como HLA-DR, grupo de diferenciación (CD)16, CD86, CD11b y CD62L, así como proteínas asociadas a la diferenciación de osteoclastos, como la integrina de superficie CD51/CD61 (integrina αVβ3), RANK (activador del receptor de nf-kappa beta) y el receptor de calcitonina por citometría de flujo.

Para caracterizar completamente los precursores de osteoclastos, la expresión de genes relacionados con osteoclastos como DC-STAMP, MITF (factor de transcripción asociado a microftalmía), CTSK (catepsina K), TRACP y ATP6v0d2 en células CD14+ se evaluará mediante polimerasa cuantitativa en tiempo real. reacción en cadena (RT-qPCR). Los resultados obtenidos se normalizarán con los genes housekeeping beta glucuronidasa (GUSB) y fosfomanomutasa-1 (PMM1).

Los datos obtenidos de los experimentos de citometría de flujo y expresión génica se compararán entre pacientes tratados y no tratados y con donantes sanos. Esta tarea nos proporcionará información cuantitativa sobre los cambios específicos de la enfermedad de la subpoblación de monocitos CD14+ y nos permitirá comprender el efecto de la terapia en las células precursoras circulantes.

Tarea 4 - Función y dinámica celular de los osteoclastos diferenciados Los monocitos CD14+ aislados se cultivarán durante 21 días en presencia de M-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos) y hrRANKL (activador del receptor recombinante humano del ligando nf-kappa beta) a 37º , 5% CO2 en placas de cultivo multipocillo.

Los osteoclastos se analizarán los días 7, 14 y 21 de cultivo para evaluar la dinámica celular. La expresión de genes específicos de osteoclastos se analizará en estos puntos de tiempo mediante RT-qPCR (ver Tarea 3). Se realizará un análisis de citometría de flujo para evaluar la expresión superficial de CD51/CD61 y RANK. Los datos obtenidos durante los puntos de tiempo (días 7, 14 y 21) de pacientes y controles sanos se compararán con los mismos datos obtenidos de las células precursoras.

En el día 21 de cultivo, las células se utilizarán en dos ensayos funcionales: tinción TRAP y ensayo de reabsorción. En el ensayo de tinción TRAP, evaluaremos el número de osteoclastos formados en cultivo contando las células multinucleadas positivas para TRAP con más de 3 núcleos (osteoclastos). La comparación de este valor con el recuento de núcleos en monocitos CD14+ en placas de cultivo nos permitirá determinar el índice de fusión de estos precursores. El ensayo de resorción se lleva a cabo mediante el cultivo de monocitos sobre cortes de hueso y nos permite medir la actividad de resorción de los osteoclastos funcionales. Esto se medirá mediante el análisis de imágenes de los cortes de hueso teñidos con azul de toluidina, donde el área reabsorbida adquiere un color azul a púrpura. El análisis de la tasa de fusión de los precursores y del área reabsorbida de los osteoclastos nos permitirá identificar diferencias en la función de los osteoclastos entre pacientes con AR y EA y donantes sanos.

Tanto los monocitos como los osteoclastos se estudiarán con respecto a RANK/RANKL y las vías de señalización de la integrina αVβ3 y c-fms que conducen al reclutamiento y activación de TRAF6, tirosina quinasa Src y quinasa regulada por señal extracelular (ERK)1/2 que activa NF- kB y otros factores de transcripción. Estas vías de señalización se estudiarán utilizando la plataforma Luminex xMAP con ensayos de señalización celular EpiQuant (Millipore). La comparación de los resultados de los pacientes no tratados y los controles nos permitirá comprender si existe un deterioro en las vías clásicas de diferenciación/activación de osteoclastos en la EA en comparación con la AR.

Los resultados obtenidos de pacientes tratados y no tratados proporcionarán información sobre la acción de las terapias en la diferenciación y función de los osteoclastos. La comparación de los resultados generales de pacientes no tratados y donantes sanos nos permitirá comprender las diferencias clave entre la diferenciación y activación de osteoclastos en estas patologías.

Tarea 5 - Función y dinámica celular de los osteoblastos En un subgrupo de pacientes con AR y EA sometidos a reemplazo de cadera o cirugía cervical se estudiará la diferenciación de osteoblastos. Inmediatamente después de la cirugía, se extraerá de la muestra un pequeño trozo de hueso trabecular (1cm3) para aislar los osteoblastos. Después del aislamiento, los osteoblastos se cultivarán en medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) suplementado con vitamina D3 (10-8 M) y las células se estudiarán al 80 % de confluencia. La función de los osteoblastos se estudiará in vitro mediante el ensayo de metiltiazol tetrazolio (MTT) (proliferación celular), tinción con fosfatasa alcalina y formación de nódulos de mineralización. Las células también se utilizarán para la extracción de ARN y el análisis de la expresión génica. Se analizarán genes específicos que codifican proteínas como osteopontina, colágeno tipo I, osteocalcina, fosfatasa alcalina, RANKL, osteoprotegerina, runx2 y osterix para caracterizar las células aisladas. Estos resultados nos permitirán comprender las diferencias en la diferenciación y actividad de los osteoblastos entre enfermedades.

Tarea 6 - Ensayos de expresión génica ósea En un subgrupo de pacientes con AR y EA sometidos a reemplazo de cadera o cirugía cervical congelaremos muestras óseas a -80ºC. Con el hueso aún congelado, una pequeña muestra de hueso trabecular se reducirá a polvo fino en un molino criogénico y la extracción de ARN se realizará con el reactivo TRIzol. El ARN resultante se evaluará en cuanto a su integridad y se cuantificará en un bioanalizador. Por tanto, el ARN extraído será el total de ARN presente en el hueso, procedente de sangre, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, adipocitos y células de la médula ósea.

La expresión génica tanto en el microambiente óseo como en las células de los estudios in vitro se evaluará mediante RT-PCR. Genes específicos que codifican proteínas tanto de osteoblastos como de osteoclastos como osteopontina, colágeno tipo I, osteocalcina, fosfatasa alcalina, RANKL, osteoprotegerina, runx2, osterix, catepsina K, subunidad de integrina beta3, receptor de calcitonina, subunidad d2 de ATPasa, TRAF6, RANK, TRAP , se estudiarán los co-receptores OSCAR y TREM-2, entre otros. La actividad de los osteocitos también se evaluará mediante la expresión de genes específicos, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, antígeno E11, MEPE y CD44. También se estudiarán los genes que codifican las citoquinas inflamatorias IL-1, IL-6, IL-17 y TNF.

Para evaluar la eficacia de la PCR, se construirán curvas estándar a partir de ARN extraído de muestras óseas congeladas de individuos con densidad mineral ósea normal y sin ninguna otra enfermedad que pueda influir en el metabolismo óseo. Los genes de interés de los osteoclastos, osteoblastos y osteocitos se cuantificarán mediante el método de la curva estándar.

El estudio de la expresión de ARN en las muestras óseas nos permitirá comprender la actividad celular local y caracterizar las células óseas y su función en un contexto de enfermedad.