Различия в активности костных клеток при ревматоидном артрите и анкилозирующем спондилите

Цели:

1. Оценить влияние клеток иммунной системы на модуляцию костного обмена у больных РА, АС и здоровых доноров (Задание 2).
2. Проанализируйте предшественники остеокластов и их дифференцировку в полнофункциональные остеокласты в подгруппе больных РА, АС и здоровых доноров (задачи 3, 4 и 6).
3. Изучение потенциала дифференцировки и активности остеобластов в подгруппе больных РА и АС (задача 5 и 6)
4. Оценить влияние терапии на дифференцировку и функцию костных клеток в подгруппе больных РА и АС, получавших блокаторы ФНО (задачи 2, 3, 4 и 5).

Рабочая программа и расписание Дата начала: июль 2011 года. Дата окончания: июль 2013 г. Задача 1. Пациенты Пациенты с диагнозом РА (в соответствии с пересмотренными критериями Американской ассоциации ревматизма, 1988 г.) и диагнозом АС (в соответствии с критериями Европейской исследовательской группы по спондилоартропатии, 1991 г.), наблюдаемые в отделении ревматологии и болезней костей и обмена веществ Для этого исследования будет привлечено отделение госпиталя Санта-Мария (HSM). В исследование будут включены 25 пациентов с активным РА (оценка активности заболевания 28 (DAS28)>3,2) и 25 пациентов с активным АС (индекс активности анкилозирующего спондилита Бата (BASDAI)>4). Пятнадцать здоровых доноров, совпадающих по полу и возрасту, будут набраны и использованы в качестве контрольной группы.

Пациентам будет представлен клинический протокол, который включает информацию о поле, возрасте, продолжительности заболевания, предыдущей терапии, наличии ревматоидного фактора и антител к циклическому цитруллинированному пептиду, статусе человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-B27, баллах DAS28 и опроснике для оценки состояния здоровья. - HAQ (опросник оценки состояния здоровья для пациентов с РА), BASDAI, Маастрихтская шкала анкилозирующего спондилита-энтезита (MASES), функциональный индекс анкилозирующего спондилита Bath - BASFI (для пациентов с АС) и шкала активности болезни Анкилозирующего спондилита (ASDAS). Кровь будет собираться у пациентов перед началом лечения глюкокортикоидами и противоревматическими препаратами, модифицирующими болезнь (DMARD: метотрексат, сульфасалазин и лефлуномид), и через 3 месяца после достижения стабильной дозы этих препаратов. У тех, кто позднее начнет прием блокаторов ФНО, образцы крови будут взяты через 6 месяцев после начала терапии. Поскольку ожидается, что только небольшая часть этой начальной когорты будет нуждаться в лечении антагонистами ФНО, вторая группа из 25 пациентов с РА и 25 АС, отобранных для начала лечения антагонистами ФНО, будет оцениваться до начала приема препарата и через 6 месяцев.

Письменное информированное согласие будет получено от всех пациентов перед любой процедурой, определенной протоколом, и это исследование будет проводиться в соответствии с правилами, регулирующими клинические испытания, такими как Хельсинкская декларация с поправками, внесенными в Токио (2004 г.). Это исследование было одобрено комитетом по этике HSM.

Все процедуры в следующих задачах будут выполняться у пациентов с РА и АС (сыворотка и кровь) и у здоровых доноров (сыворотка), если не указано иное.

Задача 2 – Изучение воспалительных стимулов и маркеров костного метаболизма Субпопуляции клеток иммунной системы (нейтрофилы, субпопуляции В- и Т-клеток, включая клетки Th17) будут проанализированы на экспрессию поверхностного RANKL с помощью проточной цитометрии.

Провоспалительные цитокины, такие как IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF и белки, модулирующие костную ткань (OPG, sRANKL, склеростин и dickkopf-1), будут количественно определены с помощью ELISA. Также будут изучены ферменты деградации кости, такие как устойчивая к тартрату кислая фосфатаза (TRAP) 5b, и маркеры метаболизма кости, такие как карбоксиконцевой сшитый телопептид коллагена I типа (ICTP) и аминоконцевой пропептид проколлагена типа 1 (P1NP).

Данные, полученные в результате экспериментов с проточной цитометрией и количественного определения белка, будут сравниваться между заболеваниями до и после лечения и со здоровыми донорами. Это позволит нам понять специфические для заболевания различия в системной и местной воспалительной среде у нелеченых пациентов и влияние различных методов лечения на эту же среду.

Задача 3. Анализ предшественников остеокластов и их дифференцировка в функциональные остеокласты. Циркулирующие клетки CD14+ будут охарактеризованы путем анализа таких маркеров, как HLA-DR, кластер дифференцировки (CD)16, CD86, CD11b и CD62L, а также белков, ассоциированных с дифференцировкой остеокластов. такие как поверхностный интегрин CD51/CD61 (интегрин αVβ3), RANK (рецептор-активатор nf-каппа-бета) и рецептор кальцитонина с помощью проточной цитометрии.

Чтобы полностью охарактеризовать предшественники остеокластов, экспрессия генов, связанных с остеокластами, таких как DC-STAMP, MITF (фактор транскрипции, связанный с микрофтальмом), CTSK (катепсин K), TRACP и ATP6v0d2 в клетках CD14+, будет оцениваться количественной полимеразой в реальном времени. цепная реакция (RT-qPCR). Полученные результаты будут нормализованы генами домашнего хозяйства бета-глюкуронидазы (GUSB) и фосфоманномутазы-1 (PMM1).

Данные, полученные с помощью проточной цитометрии и экспериментов по экспрессии генов, будут сравниваться между леченными и нелеченными пациентами и здоровыми донорами. Эта задача предоставит нам количественную информацию о специфических для заболевания изменениях субпопуляции моноцитов CD14+ и позволит нам понять влияние терапии на циркулирующие клетки-предшественники.

Задача 4 – Функция и клеточная динамика дифференцированных остеокластов. Изолированные моноциты CD14+ будут культивировать в течение 21 дня в присутствии M-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор) и hrRANKL (человеческий рекомбинантный активатор рецептора nf-каппа бета-лиганда) при 37°С. , 5% CO2 в многолуночных культуральных планшетах.

Остеокласты будут проанализированы на 7, 14 и 21 дни культивирования для оценки клеточной динамики. Экспрессия генов, специфичных для остеокластов, будет проанализирована в эти моменты времени с помощью RT-qPCR (см. Задание 3). Будет проведен анализ проточной цитометрии для оценки поверхностной экспрессии CD51/CD61 и RANK. Данные, полученные в моменты времени (дни 7, 14 и 21) от пациентов и здоровых контролей, будут сравниваться с такими же данными, полученными от клеток-предшественников.

На 21-й день культивирования клетки будут использоваться в двух функциональных анализах: окрашивании TRAP и анализе резорбции. В анализе окрашивания TRAP мы будем оценивать количество остеокластов, образовавшихся в культуре, путем подсчета TRAP-положительных многоядерных клеток с более чем 3 ядрами (остеокласты). Сравнение этого значения с числом ядер в моноцитах CD14+ в культуральных чашках позволит нам определить индекс слияния этих предшественников. Анализ резорбции проводится путем культивирования моноцитов над срезами костей и позволяет нам измерить резорбционную активность функциональных остеокластов. Это будет измерено с помощью анализа изображений срезов костей, окрашенных толуидиновым синим, где резорбированная область приобретает цвет от синего до фиолетового. Анализ скорости слияния предшественников и площади резорбции остеокластов позволит выявить различия в функции остеокластов у пациентов с РА и АС и у здоровых доноров.

Как моноциты, так и остеокласты будут изучаться в отношении сигнальных путей RANK/RANKL и интегрина αVβ3 и c-fms, которые приводят к рекрутированию и активации TRAF6, тирозинкиназы Src и киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK)1/2, активирующей NF- kB и другие факторы транскрипции. Эти сигнальные пути будут изучаться с использованием платформы Luminex xMAP с анализами передачи сигналов клеток EpiQuant (Millipore). Сравнение результатов нелеченных пациентов и контрольной группы позволит нам понять, есть ли нарушение классических путей дифференцировки/активации остеокластов при АС по сравнению с РА.

Результаты, полученные у леченных и нелеченных пациентов, позволят лучше понять действие терапии на дифференцировку и функцию остеокластов. Сравнение общих результатов нелеченных пациентов и здоровых доноров позволит нам понять ключевые различия между дифференцировкой и активацией остеокластов при этих патологиях.

Задача 5 - Функция и клеточная динамика остеобластов В подгруппе пациентов с РА и АС, перенесших замену тазобедренного сустава или операцию на шейке матки, будет изучена дифференцировка остеобластов. Сразу после операции из образца извлекают небольшой кусочек трабекулярной кости (1 см3) для выделения остеобластов. После выделения остеобласты будут культивировать в минимально необходимой среде Дульбекко (DMEM) с добавлением витамина D3 (10-8M) и исследовать клетки при 80% слиянии. Функцию остеобластов будут изучать in vitro с помощью анализа метилтиазолтетразолия (МТТ) (пролиферация клеток), окрашивания щелочной фосфатазой и образования узелков минерализации. Клетки также будут использоваться для выделения РНК и анализа экспрессии генов. Конкретные гены, которые кодируют белки, такие как остеопонтин, коллаген типа I, остеокальцин, щелочную фосфатазу, RANKL, остеопротегерин, runx2 и osterix, будут проанализированы для характеристики изолированных клеток. Эти результаты позволят нам понять различия в дифференцировке и активности остеобластов между заболеваниями.

Задача 6. Анализы экспрессии костных генов В подгруппе пациентов с РА и АС, перенесших замену тазобедренного сустава или операцию на шейке матки, мы заморозили образцы костей при температуре -80ºC. Пока кость все еще заморожена, небольшой образец трабекулярной кости будет измельчен до мелкого порошка в криогенной мельнице, а экстракция РНК будет выполнена с использованием реагента TRIzol. Полученная РНК будет оцениваться на предмет ее целостности и количественно оцениваться в биоанализаторе. Следовательно, экстрагированная РНК будет представлять собой общую РНК, присутствующую в костях, из крови, остеобластов, остеокластов, остеоцитов, адипоцитов и клеток костного мозга.

Экспрессию генов как в костном микроокружении, так и в клетках из исследований in vitro будут оценивать с помощью ОТ-ПЦР. Специфические гены, кодирующие белки как остеобластов, так и остеокластов, такие как остеопонтин, коллаген типа I, остеокальцин, щелочная фосфатаза, RANKL, остеопротегерин, runx2, osterix, катепсин K, субъединица интегрина бета3, рецептор кальцитонина, субъединица АТФазы d2, TRAF6, RANK, TRAP , среди прочего, будут изучены корецепторы OSCAR и TREM-2. Активность остеоцитов также будет оцениваться по экспрессии специфических генов, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, антигена E11, MEPE и CD44. Также будут изучены гены, кодирующие воспалительные цитокины IL-1, IL-6, IL-17 и TNF.

Для оценки эффективности ПЦР будут построены стандартные кривые на основе РНК, выделенной из замороженных образцов костей людей с нормальной минеральной плотностью костей и без каких-либо других заболеваний, которые могли бы влиять на костный метаболизм. Представляющие интерес гены остеокластов, остеобластов и остеоцитов будут количественно определены методом стандартной кривой.

Изучение экспрессии РНК в образцах костей позволит нам понять локальную клеточную активность и охарактеризовать костные клетки и их функции в контексте заболевания.