骨吸収、破骨細胞形成およびアダリムマブ (BROCA)

破骨細胞 (OC) は、関節リウマチ (RA) における骨および関節の破壊に関与する骨分解に特化した細胞です。 実験モデルは、関節炎における局所的な骨吸収に OC が不可欠であることを明確に示しています。 RANKL ノックアウト マウス (1; 2)、OPG (3-6) を投与されたラット、または c-fos(-/-) hTNF トランスジェニック マウス (7) では、関節炎の誘発により炎症が引き起こされますが、骨びらんは引き起こされません。 全身性骨粗鬆症は、RA における重要な併存疾患です (8; 9)。 OC 活性化による全身性骨吸収の増加は、早期 (2 年未満) RA でも発生し、疾患活動性と相関しています (10)。 ビスホスホネートは炎症性疾患における全身性の骨量減少の予防に効果的ですが、理由は不明ですが、関節周囲の骨びらんや関節破壊には影響を与えないようです。 最後に、対照と比較した場合の重度の関節炎患者の骨髄からのOC形成の増加によって示されるように、破骨細胞形成に影響を及ぼす全身性因子がRAに存在すると思われる(11)。

TNF-α は、RA における主要な病理学的メディエーターです。 それは、破骨細胞形成を刺激して直接的に骨吸収を誘発するか(12; 13)、骨芽細胞によるRANKL、OPGおよびプロスタグランジン産生に影響を与えることによって間接的に骨吸収を誘発する可能性があります(14; 15)。 これらの経路は、歯周炎、関節リウマチ、骨粗鬆症などのいくつかの疾患の病態生理にとって重要である可能性があります(16; 17)。 マウスでは、TNF-α は in vivo で破骨細胞前駆細胞の数を増加させますが、その役割はより複雑で、破骨細胞形成阻害メカニズムにも関与している可能性があります (18; 19)。実際、特定の条件下では、TNF-α が破骨細胞形成を減少させる可能性があるため (20)、TNF をブロックする in vivo の効果をこれらのモデルから予測するのは難しい可能性があります。

抗TNF薬はRAにおける骨破壊を軽減しますが、前の段落で説明したように、TNFは破骨細胞の形成と活性に拮抗作用があることが示されているため、この効果がどのように達成されるかは明らかではありません。 さらに、ヒトの破骨細胞生物学に対する抗 TNF 療法の効果についてはほとんど知られていません。

作業仮説

このプロジェクトは、2 つの異なる、しかし密接に関連した仮説に基づいています。

1. 抗TNF薬（この場合はアダリムマブ）による治療は、循環する破骨細胞前駆細胞の数、in vitroでの破骨細胞形成、およびin vitroでの骨吸収を減少させる可能性があります。
2. インビトロで破骨細胞を分化させるために使用される培地にアダリムマブを添加すると、破骨細胞形成と骨吸収が阻害される可能性があります。

目的

破骨細胞の骨吸収は、破骨細胞を生成する能力 (破骨細胞形成) と個々の破骨細胞の活動の両方に依存します。 我々の目的は、RA患者のアダリムマブによる治療前および治療中の、RA患者の末梢血中の破骨細胞前駆体の数、in vitroの破骨細胞形成および破骨細胞の活性に対する抗TNF療法の効果を研究することである。

研究計画

試験設計: 破骨細胞形成および破骨細胞の活動に対する抗TNF治療の影響を研究することを目的とした臨床試験として、RA患者の1つのコホートを治療開始前と治療開始後の2時点(3か月と6か月)で研究します。患者は自分自身をコントロールすることになります（研究前/後）。 治療導入後の 2 つの時点は 2 つの理由で必要です: 1) 研究されたパラメーターに対する最終的な影響がピークに達する時期が不明であること、および 2) 測定されたパラメーターが時間の経過とともに安定していることを確認するため。

結果:

主要アウトカムは、アダリムマブによる治療 (3 か月および 6 か月) の前後での以下のパラメータの差です。

1. 末梢血中の破骨細胞前駆体（CD14+）細胞の数
2. in vitroで生成された破骨細胞の数
3. in vitroでの骨吸収量

副次的結果:

1. 破骨細胞形成におけるインビトロでの薬物の直接効果を検出するために、治療患者の血漿中に見出される濃度範囲の外因性アダリムマブの存在下での並行インビトロ分化アッセイ（生成された破骨細胞の数および骨吸収の量）。
2. DAS28 スコアとして定義される疾患活動性 (21; 22)
3. M-HAQによる機能ステータスの変化 (23)

患者コホート:

対象基準：RA(24)のACR基準を満たし、シェルブルック大学病院センターのリウマチ専門医からアダリムマブの処方を受けた患者。 他の抗TNF療法を受けた患者は、以前の投薬の半減期が5回経過した後にのみ適格となります。 患者はインフォームドコンセントに積極的に署名する必要があります。 抗 TNF 薬やその他の生物学的製剤以外の併用薬の併用は許可されており、治療を行うリウマチ専門医は患者の最善の利益に合わせて薬の調整を行うことができます。 したがって、この研究は患者の日常的な治療には影響を与えません。 併用薬は記録され、最終分析で考慮されます。

除外基準：18歳未満の患者、またはインフォームドコンセントを提供する能力または提供する意思がない患者、以前の抗TNF療法の中断後5半減期未満でアダリムマブを開始した患者。

サンプルサイズと統計: サンプルサイズは、主要結果、つまり in vitro で生成された破骨細胞の数の分布と分散に基づいて計算されました。 私たちの研究室の51人の正常なドナーの集団から生成された破骨細胞の数は、601.1±156.8破骨細胞/ウェルでした（データは2007年のカナダリウマチ学会年次総会で発表され、Journal of Rheumatologyに掲載中）。 テストの有意水準 5% (α = 0.05) とグループ間の少なくとも 100 個の破骨細胞/ウェルの差を検出する検出力 80% を考慮しました (対応のある両側 t 検定)。患者数は22名。 技術的な理由による 10% の損失を考慮して、サンプル サイズは 25 人の患者で確立されました。

方法論

血液サンプル: アダリムマブによる治療開始の 2 か月以内、および薬剤の最初の投与後 3 か月および 6 か月後 (± 2 週間) に、各患者からヘパリンに溶解した血液 50 ml を採取します。 DAS-28、HAQ スコア、併存疾患、および併用薬が同時に決定および記録され、コード化されたデータは安全なデータベースに保存されます。

破骨細胞の研究:

破骨細胞形成: PBMC は、Ficoll-Hypaque 勾配によって 50 ml の血液から単離され、CD14+ OC 前駆体の数は FACS によって決定されます。 PBMC の全集団を骨スライスまたはスライドガラスを含む 48 ウェル組織培養プレートに播種し、組換え RANKL (75 ng/ml) および M- ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）。 次に、細胞を固定し、ヘマトキシリンで TRAP 活性について染色します。 3 つ以上の核を含む TRAP+ 細胞の数が各ウェルでカウントされます。 各患者に対して三重反復が使用される。 平行したウェルで、細胞は同じ条件でインキュベートされますが、処理後にインビボで見られるものと同等の濃度のアダリムマブが存在します。

OC 吸収活性: 骨吸収アッセイでは、骨スライス上で 21 日間分化させた細胞を TRAP および 0.2 % トルイジン ブルーで染色します。 吸収表面積は、画像解析プログラム Simple PCI を使用して定量化されます。 並行アッセイはアダリムマブの存在下で行われます。

統計分析：

介入前後のグループは、正規分布を持つ変数に対するパラメトリック一対両側検定を使用し、必要に応じてノンパラメトリック検定を使用して比較されます。

期待される結果

これらの研究により、アダリムマブによる治療が循環する破骨細胞前駆細胞の数、破骨細胞の生成、およびこれらの細胞の骨吸収活性に影響を与えるかどうかを判断できるようになります。 また、生体内で見出される濃度のアダリムマブがヒトの破骨細胞形成と骨吸収に直接影響を与える可能性があるかどうかを判断することも可能になります。 おそらくより重要なことは、破骨細胞の結果と研究された臨床パラメーターとの相関関係により、破骨細胞に対する最終的な影響が薬物療法に対する臨床反応と相関するかどうかについて洞察が得られる可能性があり、関節リウマチにおけるアダリムマブの追加の作用機序の可能性を示しています。