Riassorbimento osseo, Osteoclastogenesi e Adalimumab (BROCA)

Gli osteoclasti (OC) sono cellule specializzate nella degradazione ossea che partecipano alla distruzione ossea e articolare nell'artrite reumatoide (AR). I modelli sperimentali hanno chiaramente dimostrato che gli OC sono essenziali per il riassorbimento osseo locale nell'artrite. Nei topi knockout RANKL(1; 2), nei ratti trattati con OPG(3-6) o nei topi transgenici c-fos(-/-) hTNF(7) l'induzione dell'artrite porta all'infiammazione ma non all'erosione ossea. L'osteoporosi sistemica è un'importante comorbidità nell'AR (8; 9). L'aumento del riassorbimento osseo sistemico dovuto all'attivazione di OC si verifica anche nella RA precoce (<2 anni) e si correla con l'attività della malattia(10). I bifosfonati sono efficaci nella prevenzione della perdita ossea sistemica nelle malattie infiammatorie, ma per ragioni sconosciute non sembrano influenzare l'erosione ossea periarticolare e la distruzione articolare. Infine, un fattore sistemico che influenza l'osteoclastogenesi sembra essere presente nell'AR, come dimostrato da un'aumentata formazione di OC dal midollo osseo dei pazienti con artrite grave rispetto ai controlli (11).

Il TNF-alfa è un importante mediatore patologico dell'artrite reumatoide. Può indurre il riassorbimento osseo direttamente, stimolando l'osteoclastogenesi (12; 13) o indirettamente, influenzando RANKL, OPG e la produzione di prostaglandine da parte degli osteoblasti (14; 15). Questi percorsi possono essere importanti per la fisiopatologia di diverse malattie come la parodontite, l'artrite reumatoide e l'osteoporosi (16; 17). Nel topo, il TNF-alfa aumenta il numero di precursori degli osteoclasti in vivo, ma il suo ruolo potrebbe essere più complesso e implicare anche meccanismi di inibizione dell'osteoclastogenesi (18; 19); infatti, in determinate condizioni, il TNF-alfa può diminuire l'osteoclastogenesi(20), quindi l'effetto in vivo del blocco del TNF può essere difficile da prevedere da questi modelli.

Gli agenti anti-TNF riducono la distruzione ossea nell'AR ma non è chiaro come si ottenga questo effetto poiché, come descritto nel paragrafo precedente, è stato dimostrato che il TNF ha effetti antagonisti nella formazione e nell'attività degli osteoclasti. Inoltre, si sa poco dell'effetto della terapia anti-TNF sulla biologia degli osteoclasti nell'uomo.

Ipotesi di lavoro

Questo progetto si basa su due ipotesi diverse ma strettamente correlate:

1. Il trattamento con agenti anti-TNF (Adalimumab in questo caso) può ridurre il numero di precursori degli osteoclasti circolanti, l'osteoclastogenesi in vitro e il riassorbimento osseo in vitro.
2. L'aggiunta di Adalimumab al terreno di coltura utilizzato per differenziare gli osteoclasti in vitro può inibire l'osteoclastogenesi e il riassorbimento osseo.

Obiettivi

Il riassorbimento osseo osteoclastico dipende sia dalla capacità di generare osteoclasti (osteoclastogenesi) sia dall'attività individuale degli osteoclasti. Il nostro obiettivo è studiare l'effetto della terapia anti-TNF sul numero di precursori degli osteoclasti nel sangue periferico di pazienti con AR, sull'osteoclastogenesi in vitro e sull'attività degli osteoclasti prima e durante il trattamento di pazienti con AR con Adalimumab.

Piano di ricerca

Disegno dello studio: come percorso clinico volto a studiare l'impatto del trattamento anti-TNF sull'osteoclastogenesi e sull'attività degli osteoclasti, studieremo una coorte di pazienti con AR prima e in due punti dopo l'inizio della terapia, 3 e 6 mesi, in modo che ciascuno paziente sarà il suo controllo (prima/dopo lo studio). I due punti temporali dopo l'introduzione della terapia sono necessari per due motivi: 1) Non è noto il momento in cui un eventuale effetto sui parametri studiati può raggiungere il suo picco e 2) Per garantire che i parametri misurati siano stabili nel tempo.

Risultati:

Gli esiti primari saranno la differenza nei seguenti parametri prima e dopo il trattamento con Adalimumab (3 e 6 mesi):

1. il numero di cellule precursori degli osteoclasti (CD14+) nel sangue periferico
2. il numero di osteoclasti generati in vitro
3. la quantità di riassorbimento osseo in vitro

Risultati secondari:

1. Saggi paralleli di differenziazione in vitro (numero di osteoclasti generati e quantità di riassorbimento osseo) in presenza di Adalimumab esogeno nell'intervallo di concentrazione trovato nel plasma dei pazienti trattati per rilevare un effetto diretto del farmaco in vitro sull'osteoclastogenesi.
2. attività della malattia definita come punteggio DAS28 (21; 22)
3. Modifica dello stato funzionale da parte dell'M-HAQ (23)

Coorte di pazienti:

Criteri di inclusione: pazienti che soddisfano i criteri ACR per RA(24) e che hanno ricevuto una prescrizione di Adalimumab da un reumatologo presso il Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. I pazienti che hanno ricevuto altre terapie anti-TNF sono eleggibili solo dopo 5 emivite del farmaco precedente. I pazienti devono essere disposti a firmare un consenso informato. Sono consentiti farmaci concomitanti diversi dagli anti-TNF e altri farmaci biologici e il reumatologo curante può adattarli al miglior interesse dei pazienti. Questo studio non ha quindi alcun impatto sul trattamento di routine dei pazienti. I farmaci concomitanti saranno registrati e considerati nell'analisi finale.

Criteri di esclusione: pazienti di età inferiore a 18 anni o non in grado o disposti a fornire il consenso informato, pazienti che iniziano Adalimumab meno di cinque emivite dopo l'interruzione di una precedente terapia anti-TNF.

Dimensione del campione e statistiche: la dimensione del campione è stata calcolata in base alla distribuzione e alla varianza dell'esito primario, ovvero il numero di osteoclasti generati in vitro. Da una popolazione di 51 donatori normali nel nostro laboratorio il numero di osteoclasti generati è stato di 601,1 ± 156,8 osteoclasti/pozzetto (dati presentati al meeting annuale 2007 della Canadian Rheumatology Association, in corso di stampa sul Journal of Rheumatology). Abbiamo considerato un livello di significatività del test del 5% (α = 0,05) e la potenza dell'80% per rilevare una differenza di almeno 100 osteoclasti/pozzetto tra i gruppi (test t a due code accoppiato), che ha portato a un totale di 22 pazienti. Considerando una perdita del 10% dovuta a motivi tecnici, la dimensione del campione è stata stabilita in 25 pazienti.

Metodologia

Campioni di sangue: da ciascun paziente verranno prelevati 50 ml di sangue in eparina non più di 2 mesi prima dell'inizio del trattamento con Adalimumab e 3 e sei mesi dopo la prima somministrazione del farmaco (± 2 settimane). DAS-28, punteggi HAQ, comorbilità e farmaci concomitanti saranno determinati e registrati contemporaneamente e i dati codificati verranno archiviati in un database sicuro.

Studi sugli osteoclasti:

Osteoclastogenesi: le PBMC saranno isolate da 50 ml di sangue mediante gradiente Ficoll-Hypaque e il numero di precursori CD14+ OC sarà determinato mediante FACS. L'intera popolazione di PBMC sarà piastrata in piastre di coltura tissutale da 48 pozzetti contenenti una fetta ossea o un vetrino, e le cellule saranno lasciate differenziare per 21 giorni in presenza di RANKL ricombinante (75 ng/ml) e M- CSF (10 ng/ml). Le cellule vengono quindi fissate e colorate per l'attività TRAP e con ematossilina. In ciascun pozzetto verrà contato il numero di cellule TRAP+ contenenti tre o più nuclei. Saranno utilizzati triplicati per ogni paziente. In pozzetti paralleli le cellule saranno incubate nelle stesse condizioni ma in presenza di Adalimumab in concentrazione paragonabile a quella trovata in vivo dopo il trattamento.

Attività di riassorbimento dell'OC: per i saggi di riassorbimento osseo, le cellule differenziate per 21 giorni su fettine ossee saranno colorate per TRAP e blu di toluidina allo 0,2%. L'area della superficie di riassorbimento sarà quantificata utilizzando il programma di analisi delle immagini Simple PCI. Saranno eseguiti saggi paralleli in presenza di Adalimumab.

Analisi statistica:

I gruppi prima e dopo l'intervento saranno confrontati utilizzando test parametrici accoppiati a due code per le variabili con distribuzione normale e con test non parametrici ove opportuno.

Risultati previsti

Questi studi ci permetteranno di determinare se il trattamento con Adalimumab ha un effetto sul numero di precursori osteoclastici circolanti, sulla generazione di osteoclasti e sull'attività di riassorbimento osseo di queste cellule. Consentirà inoltre di determinare se Adalimumab, nelle concentrazioni riscontrate in vivo, possa avere un impatto diretto sull'osteoclastogenesi umana e sul riassorbimento osseo. Forse ancora più importante, la correlazione dei risultati degli osteoclasti con i parametri clinici studiati può permetterci di capire se un eventuale effetto sugli osteoclasti possa essere correlato alla risposta clinica al farmaco, indicando un possibile meccanismo d'azione aggiuntivo di Adalimumab nell'artrite reumatoide.