Botresorptie, Osteoclastogenese en Adalimumab (BROCA)

Osteoclasten (OC's) zijn cellen gespecialiseerd in botafbraak die deelnemen aan bot- en gewrichtsvernietiging bij reumatoïde artritis (RA). Experimentele modellen hebben duidelijk aangetoond dat OC's essentieel zijn voor lokale botresorptie bij artritis. Bij RANKL knock-out muizen(1; 2), bij ratten die OPG(3-6) kregen of bij c-fos(-/-) hTNF transgene muizen(7) leidt inductie van artritis tot ontsteking maar niet tot boterosie. Systemische osteoporose is een belangrijke comorbiditeit bij RA(8; 9). Verhoogde systemische botresorptie als gevolg van OC-activering treedt zelfs op bij vroege (< 2 jaar) RA en correleert met ziekteactiviteit(10). Bisfosfonaten zijn effectief in het voorkomen van systemisch botverlies bij ontstekingsziekten, maar lijken om onbekende redenen geen invloed te hebben op periarticulaire boterosie en gewrichtsvernietiging. Ten slotte lijkt er een systemische factor aanwezig te zijn die de osteoclastogenese beïnvloedt bij RA, zoals blijkt uit een verhoogde vorming van OC's uit het beenmerg van patiënten met ernstige artritis in vergelijking met controles(11).

TNF-alfa is een belangrijke pathologische mediator bij RA. Het kan botresorptie induceren, ofwel direct, waardoor osteoclastogenese wordt gestimuleerd(12; 13) of indirect, door de productie van RANKL, OPG en prostaglandine door osteoblasten te beïnvloeden(14; 15). Deze routes kunnen belangrijk zijn voor de pathofysiologie van verschillende ziekten zoals parodontitis, reumatoïde artritis en osteoporose(16; 17). Bij muizen verhoogt TNF-alfa het aantal osteoclastvoorlopers in vivo, maar zijn rol kan echter complexer zijn en ook osteoclastogenese-remmende mechanismen impliceren(18; 19); in feite kan TNF-alfa onder bepaalde omstandigheden de osteoclastogenese verminderen(20), dus het in vivo effect van het blokkeren van TNF kan moeilijk te voorspellen zijn op basis van deze modellen.

Anti-TNF-middelen verminderen botafbraak bij RA, maar het is niet duidelijk hoe dit effect wordt bereikt, aangezien, zoals beschreven in de voorgaande paragraaf, is aangetoond dat TNF antagonistische effecten heeft op de vorming en activiteit van osteoclasten. Bovendien is er weinig bekend over het effect van anti-TNF-therapie op de osteoclastbiologie bij de mens.

Werkhypothese

Dit project is gebaseerd op twee verschillende maar nauw verwante hypothesen:

1. Behandeling met anti-TNF-middelen (in dit geval Adalimumab) kan het aantal circulerende osteoclastvoorlopers, in vitro osteoclastogenese en in vitro botresorptie verminderen.
2. Toevoeging van Adalimumab aan het kweekmedium dat wordt gebruikt om osteoclasten in vitro te differentiëren, kan osteoclastogenese en botresorptie remmen.

Doelstellingen

Osteoclastische botresorptie hangt af van zowel het vermogen om osteoclasten te genereren (osteoclastogenese) als van individuele osteoclastactiviteit. Ons doel is om het effect te bestuderen van anti-TNF-therapie op het aantal osteoclastvoorlopers in het perifere bloed van patiënten met RA, op in vitro osteoclastogenese en op osteoclastactiviteit voor en tijdens de behandeling van patiënten met RA met Adalimumab.

Onderzoeksplan

Proefopzet: Als klinisch onderzoek gericht op het bestuderen van de impact van anti-TNF-behandeling op osteoclastogenese en osteoclastactiviteit zullen we één cohort van patiënten met RA bestuderen voor en op twee punten na het begin van de therapie, 3 en 6 maanden, zodat elk patiënt zal zijn/haar eigen controle zijn (voor/na studie). De twee tijdstippen na introductie van de therapie zijn nodig om twee redenen: 1) Het tijdstip waarop een eventueel effect op de bestudeerde parameters zijn hoogtepunt kan bereiken, is niet bekend en 2) Om te verzekeren dat de gemeten parameters stabiel zijn in de tijd.

Uitkomsten:

Primaire uitkomsten zijn het verschil in de volgende parameters voor en na behandeling met Adalimumab (3 en 6 maanden):

1. het aantal osteoclastprecursorcellen (CD14+) in het perifere bloed
2. het aantal in vitro gegenereerde osteoclasten
3. de hoeveelheid botresorptie in vitro

Secundaire uitkomsten:

1. Parallelle in vitro differentiatietesten (aantal gegenereerde osteoclasten en hoeveelheid botresorptie) in de aanwezigheid van exogeen Adalimumab in het concentratiebereik gevonden in het plasma van behandelde patiënten om een ​​direct effect van de medicatie in vitro in osteoclastogenese te detecteren.
2. ziekteactiviteit gedefinieerd als een DAS28-score (21; 22)
3. Verandering in functionele status door de M-HAQ (23)

Patiëntencohort:

Inclusiecriteria: Patiënten die voldoen aan de ACR-criteria voor RA(24) en die een voorschrift van Adalimumab hebben gekregen van een reumatoloog in het Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Patiënten die andere anti-TNF-therapieën hebben gekregen, komen pas in aanmerking na 5 halfwaardetijden van de vorige medicatie. Patiënten moeten bereid zijn om een ​​geïnformeerde toestemming te ondertekenen. Gelijktijdige medicatie anders dan anti-TNF's en andere biologische geneesmiddelen is toegestaan ​​en de behandelend reumatoloog kan deze aanpassen in het belang van de patiënt. Deze studie heeft dus geen invloed op de routinematige behandeling van de patiënten. Gelijktijdige medicatie wordt geregistreerd en meegenomen in de uiteindelijke analyse.

Uitsluitingscriteria: Patiënten jonger dan 18 jaar of niet in staat of bereid om geïnformeerde toestemming te geven, patiënten die beginnen met Adalimumab minder dan vijf halfwaardetijden na de onderbreking van een eerdere anti-TNF-therapie.

Steekproefomvang en statistieken: De steekproefomvang werd berekend op basis van de verdeling en variantie van de primaire uitkomst, d.w.z. het aantal in vitro gegenereerde osteoclasten. Uit een populatie van 51 normale donoren in ons laboratorium was het aantal gegenereerde osteoclasten 601,1 ± 156,8 osteoclasten/putje (gegevens gepresenteerd op de jaarlijkse bijeenkomst van de Canadian Rheumatology Association in 2007, gepubliceerd in het Journal of Rheumatology). We hebben een testsignificantieniveau van 5% (α = 0,05) en het vermogen van 80% overwogen om een ​​verschil van ten minste 100 osteoclasten/well tussen de groepen te detecteren (gepaarde tweezijdige t-test), wat leidde tot een totaal van 22 patiënten. Rekening houdend met een verlies van 10% vanwege technische redenen, werd de steekproefomvang vastgesteld op 25 patiënten.

Methodologie

Bloedmonsters: Uiterlijk 2 maanden voor aanvang van de behandeling met Adalimumab en 3 en 6 maanden na de eerste toediening van het geneesmiddel (± 2 weken) wordt bij elke patiënt 50 ml bloed in heparine afgenomen. DAS-28, HAQ-scores, comorbiditeiten en gelijktijdige medicatie worden op dezelfde momenten bepaald en geregistreerd en de gecodeerde gegevens worden opgeslagen in een beveiligde database.

Osteoclast-onderzoeken:

Osteoclastogenese: PBMC's zullen worden geïsoleerd uit 50 ml bloed door Ficoll-Hypaque-gradiënt en het aantal CD14+ OC-voorlopers zal worden bepaald door FACS. De hele populatie van PBMC's zal worden uitgeplaat in weefselkweekplaten met 48 putjes die een botplak of een glasplaatje bevatten, en de cellen zullen gedurende 21 dagen kunnen differentiëren in aanwezigheid van recombinant RANKL (75 ng/ml) en M- CSF (10 ng/ml). De cellen worden vervolgens gefixeerd en gekleurd op TRAP-activiteit en met hematoxyline. In elk putje wordt het aantal TRAP+-cellen met drie of meer kernen geteld. Triplo's zullen voor elke patiënt worden gebruikt. In parallelle putjes zullen de cellen onder dezelfde omstandigheden worden geïncubeerd, maar in aanwezigheid van Adalimumab in een concentratie die vergelijkbaar is met die gevonden in vivo na behandeling.

OC-resorptieve activiteit: Voor botresorptie-assays worden gedurende 21 dagen op botplakjes gedifferentieerde cellen gekleurd voor TRAP en 0,2% toluïdineblauw. Het resorptieoppervlak wordt gekwantificeerd met behulp van het beeldanalyseprogramma Simple PCI. Parallelle assays zullen worden uitgevoerd in aanwezigheid van Adalimumab.

Statistische analyse:

De groepen voor en na de interventie zullen worden vergeleken met behulp van parametrische gepaarde tweezijdige toetsen voor de variabelen met een normale verdeling en waar nodig met niet-parametrische toetsen.

Verwachte resultaten

Met deze studies kunnen we bepalen of de behandeling met Adalimumab een effect heeft op het aantal circulerende osteoclastprecursoren, op het genereren van osteoclasten en op de botresorberende activiteit van deze cellen. Het zal het ook mogelijk maken om te bepalen of Adalimumab, in in vivo gevonden concentraties, een directe invloed kan hebben op menselijke osteoclastogenese en botresorptie. Misschien nog belangrijker is dat correlatie van de osteoclastresultaten met de bestudeerde klinische parameters ons inzicht kan geven in de vraag of een eventueel effect op osteoclasten kan correleren met de klinische respons op de medicatie, wat wijst op een mogelijk aanvullend werkingsmechanisme van Adalimumab bij reumatoïde artritis.