Résorption osseuse, ostéoclastogenèse et adalimumab (BROCA)

Les ostéoclastes (OC) sont des cellules spécialisées dans la dégradation osseuse qui participent à la destruction osseuse et articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Des modèles expérimentaux ont clairement démontré que les CO sont essentiels à la résorption osseuse locale dans l'arthrite. Chez les souris RANKL knock-out(1 ; 2), chez les rats recevant de l'OPG(3-6) ou chez les souris transgéniques c-fos(-/-) hTNF(7), l'induction de l'arthrite entraîne une inflammation mais pas une érosion osseuse. L'ostéoporose systémique est une comorbidité importante dans la PR(8; 9). Une augmentation de la résorption osseuse systémique due à l'activation du CO se produit même au début de la PR (< 2 ans) et est corrélée à l'activité de la maladie(10). Les bisphosphonates sont efficaces pour prévenir la perte osseuse systémique dans les maladies inflammatoires, mais pour des raisons inconnues, ils ne semblent pas influencer l'érosion osseuse périarticulaire et la destruction articulaire. Enfin, un facteur systémique affectant l'ostéoclastogenèse semble être présent dans la PR, comme le montre une formation accrue de CO à partir de la moelle osseuse des patients atteints d'arthrite sévère par rapport aux témoins(11).

Le TNF-alpha est un médiateur pathologique majeur dans la PR. Il peut induire la résorption osseuse soit directement, en stimulant l'ostéoclastogenèse(12; 13), soit indirectement, en influençant la production de RANKL, d'OPG et de prostaglandines par les ostéoblastes(14; 15). Ces voies peuvent être importantes pour la physiopathologie de plusieurs maladies telles que la parodontite, la polyarthrite rhumatoïde et l'ostéoporose(16; 17). Chez la souris, le TNF-alpha augmente le nombre de précurseurs des ostéoclastes in vivo mais son rôle peut cependant être plus complexe et impliquer également des mécanismes inhibiteurs de l'ostéoclastogenèse(18 ; 19) ; en fait, dans certaines conditions, le TNF-alpha peut diminuer l'ostéoclastogenèse(20), de sorte que l'effet in vivo du blocage du TNF peut être difficile à prédire à partir de ces modèles.

Les agents anti-TNF réduisent la destruction osseuse dans la PR mais on ne sait pas comment cet effet est obtenu car, comme décrit dans le paragraphe précédent, il a été démontré que le TNF a des effets antagonistes sur la formation et l'activité des ostéoclastes. De plus, on sait peu de choses sur l'effet de la thérapie anti-TNF sur la biologie des ostéoclastes chez l'homme.

Hypothèse de travail

Ce projet repose sur deux hypothèses différentes mais étroitement liées :

1. Le traitement avec des agents anti-TNF (Adalimumab dans ce cas) peut réduire le nombre de précurseurs ostéoclastiques circulants, l'ostéoclastogenèse in vitro et la résorption osseuse in vitro.
2. L'ajout d'adalimumab au milieu de culture utilisé pour différencier les ostéoclastes in vitro peut inhiber l'ostéoclastogenèse et la résorption osseuse.

Objectifs

La résorption osseuse ostéoclastique dépend à la fois de la capacité à générer des ostéoclastes (ostéoclastogenèse) et de l'activité individuelle des ostéoclastes. Notre objectif est d'étudier l'effet de la thérapie anti-TNF sur le nombre de précurseurs ostéoclastiques dans le sang périphérique des patients atteints de PR, sur l'ostéoclastogenèse in vitro et sur l'activité des ostéoclastes avant et pendant le traitement des patients atteints de PR par l'Adalimumab.

Plan de recherche

Conception de l'essai : Dans le cadre d'un essai clinique visant à étudier l'impact du traitement anti-TNF sur l'ostéoclastogenèse et l'activité des ostéoclastes, nous étudierons une cohorte de patients atteints de PR avant et à deux moments après le début de la thérapie, 3 et 6 mois, de sorte que chaque le patient sera son propre témoin (avant/après l'étude). Les deux moments après introduction de la thérapie sont nécessaires pour deux raisons : 1) Le moment où un éventuel effet sur les paramètres étudiés peut atteindre son maximum n'est pas connu et 2) Pour s'assurer que les paramètres mesurés sont stables dans le temps.

Résultats :

Les critères de jugement principaux seront la différence entre les paramètres suivants avant et après le traitement par l'adalimumab (3 et 6 mois) :

1. le nombre de cellules précurseurs des ostéoclastes (CD14+) dans le sang périphérique
2. le nombre d'ostéoclastes générés in vitro
3. la quantité de résorption osseuse in vitro

Résultats secondaires :

1. Essais parallèles de différenciation in vitro (nombre d'ostéoclastes générés et quantité de résorption osseuse) en présence d'Adalimumab exogène dans la gamme de concentration trouvée dans le plasma des patients traités pour détecter un effet direct du médicament in vitro sur l'ostéoclastogenèse.
2. activité de la maladie définie par un score DAS28 (21 ; 22)
3. Changement d'état fonctionnel par le M-HAQ (23)

Cohorte de patients :

Critères d'inclusion : Patients répondant aux critères ACR de PR(24) et ayant reçu une ordonnance d'Adalimumab d'un rhumatologue du Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Les patients ayant reçu d'autres thérapies anti-TNF ne sont éligibles qu'après 5 demi-vies du médicament précédent. Les patients doivent être disposés à signer un consentement éclairé. La prise concomitante de médicaments autres que les anti-TNF et d'autres produits biologiques est autorisée et le rhumatologue traitant peut l'ajuster au mieux de l'intérêt des patients. Cette étude n'a donc pas d'impact sur le traitement de routine des patients. Les médicaments concomitants seront enregistrés et pris en compte dans l'analyse finale.

Critères d'exclusion : Patients de moins de 18 ans ou incapables ou incapables de donner un consentement éclairé, patients débutant l'Adalimumab moins de cinq demi-vies après l'interruption d'un précédent traitement anti-TNF.

Taille de l'échantillon et statistiques : la taille de l'échantillon a été calculée sur la base de la distribution et de la variance du résultat principal, c'est-à-dire le nombre d'ostéoclastes générés in vitro. À partir d'une population de 51 donneurs normaux dans notre laboratoire, le nombre d'ostéoclastes générés était de 601,1 ± 156,8 ostéoclastes/puits (données présentées à la réunion annuelle 2007 de l'Association canadienne de rhumatologie, sous presse au Journal of Rheumatology). Nous avons considéré un niveau de signification du test de 5 % (α = 0,05) et la puissance de 80 % pour détecter une différence d'au moins 100 ostéoclastes/puits entre les groupes (test t bilatéral apparié), ce qui a conduit à un total de 22 malades. Considérant une perte de 10 % pour des raisons techniques, la taille de l'échantillon a été établie à 25 patients.

Méthodologie

Prélèvements sanguins : 50 ml de sang dans l'héparine seront prélevés sur chaque patient pas plus de 2 mois avant le début du traitement par l'adalimumab et 3 et 6 mois après la première administration du médicament (± 2 semaines). Le DAS-28, les scores HAQ, les comorbidités et les médicaments concomitants seront déterminés et enregistrés en même temps et les données codées stockées dans une base de données sécurisée.

Études sur les ostéoclastes :

Ostéoclastogenèse : Les PBMC seront isolées à partir de 50 ml de sang par gradient Ficoll-Hypaque et le nombre de précurseurs CD14+ OC sera déterminé par FACS. L'ensemble de la population de PBMC sera étalée dans des plaques de culture tissulaire à 48 puits contenant une tranche d'os ou une lame de verre, et les cellules pourront se différencier pendant 21 jours en présence de RANKL recombinant (75 ng/ml) et de M- LCR (10 ng/ml). Les cellules sont ensuite fixées et colorées pour l'activité TRAP et avec de l'hématoxyline. Le nombre de cellules TRAP+ contenant trois noyaux ou plus sera compté dans chaque puits. Des triplicats seront utilisés pour chaque patient. Dans des puits parallèles les cellules seront incubées dans les mêmes conditions mais en présence d'Adalimumab à une concentration comparable à celle retrouvée in vivo après traitement.

Activité de résorption de l'OC : Pour les tests de résorption osseuse, les cellules différenciées pendant 21 jours sur des tranches d'os seront colorées pour TRAP et 0,2 % de bleu de toluidine. La surface de résorption sera quantifiée à l'aide du programme d'analyse d'image, Simple PCI. Des dosages parallèles seront effectués en présence d'Adalimumab.

Analyses statistiques:

Les groupes avant et après intervention seront comparés à l'aide de tests paramétriques bilatéraux appariés pour les variables avec une distribution normale et avec des tests non paramétriques le cas échéant.

Résultats attendus

Ces études permettront de déterminer si le traitement par Adalimumab a un effet sur le nombre de précurseurs ostéoclastiques circulants, sur la génération d'ostéoclastes et sur l'activité de résorption osseuse de ces cellules. Elle permettra également de déterminer si l'adalimumab, à des concentrations trouvées in vivo, peut avoir un impact direct sur l'ostéoclastogenèse humaine et la résorption osseuse. Peut-être plus important encore, la corrélation des résultats des ostéoclastes avec les paramètres cliniques étudiés peut nous permettre de savoir si un effet éventuel sur les ostéoclastes peut être corrélé à la réponse clinique au médicament, indiquant un éventuel mécanisme d'action supplémentaire de l'adalimumab dans la polyarthrite rhumatoïde.