Резорбция кости, остеокластогенез и адалимумаб (BROCA)

Остеокласты (ОК) представляют собой клетки, специализирующиеся на деградации костей, которые участвуют в разрушении костей и суставов при ревматоидном артрите (РА). Экспериментальные модели ясно продемонстрировали, что ОК необходимы для локальной резорбции кости при артрите. У мышей с нокаутом RANKL (1; 2), у крыс, получавших OPG (3-6), или у трансгенных мышей c-fos (-/-) hTNF (7) индукция артрита приводит к воспалению, но не к эрозии кости. Системный остеопороз является важным сопутствующим заболеванием при РА (8; 9). Повышенная системная резорбция костной ткани из-за активации ОК наблюдается даже при раннем (< 2 лет) РА и коррелирует с активностью заболевания (10). Бисфосфонаты эффективны в предотвращении системной потери костной массы при воспалительных заболеваниях, но по неизвестным причинам, по-видимому, не влияют на периартикулярную эрозию костей и разрушение суставов. Наконец, при РА, по-видимому, присутствует системный фактор, влияющий на остеокластогенез, о чем свидетельствует повышенное образование ОК в костном мозге пациентов с тяжелым артритом по сравнению с контрольной группой (11).

ФНО-альфа является основным патологическим медиатором при РА. Он может вызывать резорбцию кости либо напрямую, стимулируя остеокластогенез (12, 13), либо косвенно, влияя на RANKL, OPG и продукцию простагландинов остеобластами (14, 15). Эти пути могут быть важны для патофизиологии ряда заболеваний, таких как пародонтит, ревматоидный артрит и остеопороз (16, 17). У мышей TNF-альфа увеличивает количество предшественников остеокластов in vivo, но его роль может быть, однако, более сложной и включать также механизмы ингибирования остеокластогенеза (18, 19); на самом деле, в определенных условиях TNF-альфа может снижать остеокластогенез (20), поэтому эффект блокирования TNF in vivo может быть трудно предсказать с помощью этих моделей.

Агенты против TNF уменьшают разрушение костей при РА, но неясно, как достигается этот эффект, поскольку, как описано в предыдущем абзаце, было показано, что TNF оказывает антагонистическое действие на образование и активность остеокластов. Более того, мало что известно о влиянии анти-ФНО терапии на биологию остеокластов у человека.

Рабочая гипотеза

Этот проект основан на двух разных, но тесно связанных гипотезах:

1. Лечение препаратами против TNF (в данном случае адалимумабом) может уменьшить количество циркулирующих предшественников остеокластов, остеокластогенез in vitro и резорбцию кости in vitro.
2. Добавление адалимумаба в культуральную среду, используемую для дифференциации остеокластов in vitro, может ингибировать остеокластогенез и резорбцию кости.

Цели

Остеокластическая резорбция кости зависит как от способности генерировать остеокласты (остеокластогенез), так и от индивидуальной активности остеокластов. Нашей целью является изучение влияния анти-ФНО терапии на количество предшественников остеокластов в периферической крови больных РА, на остеокластогенез in vitro и на активность остеокластов до и во время лечения больных РА адалимумабом.

План исследования

Дизайн исследования: В качестве клинического следа, направленного на изучение влияния лечения анти-ФНО на остеокластогенез и активность остеокластов, мы изучим одну когорту пациентов с РА до и в двух точках после начала терапии, через 3 и 6 месяцев, так что каждый пациент будет его/ее собственным контролем (до/после исследования). Два временных момента после введения терапии необходимы по двум причинам: 1) время, когда возможное воздействие на изучаемые параметры может достичь своего пика, неизвестно, и 2) чтобы гарантировать стабильность измеряемых параметров во времени.

Результаты:

Первичными результатами будет разница следующих параметров до и после лечения адалимумабом (3 и 6 месяцев):

1. количество клеток-предшественников остеокластов (CD14+) в периферической крови
2. количество остеокластов, генерируемых in vitro
3. степень резорбции кости in vitro

Вторичные результаты:

1. Параллельные анализы дифференцировки in vitro (количество образовавшихся остеокластов и степень резорбции кости) в присутствии экзогенного адалимумаба в диапазоне концентраций, обнаруживаемых в плазме пациентов, получавших лечение, для выявления прямого влияния препарата in vitro на остеокластогенез.
2. активность заболевания определяется по шкале DAS28 (21; 22)
3. Изменение функционального состояния с помощью M-HAQ (23)

Когорта пациентов:

Критерии включения: пациенты, отвечающие критериям ACR для РА(24) и получившие рецепт на адалимумаб от ревматолога в Университетском госпитальном центре Шербрука. Пациенты, получавшие другую терапию против TNF, имеют право на участие только после 5 периодов полувыведения предыдущего препарата. Пациенты должны быть готовы подписать информированное согласие. Сопутствующее лечение, кроме анти-ФНО и других биологических препаратов, разрешено, и лечащий ревматолог может скорректировать его в соответствии с интересами пациентов. Таким образом, это исследование не повлияло на рутинное лечение пациентов. Сопутствующее лечение будет зарегистрировано и учтено в окончательном анализе.

Критерии исключения: пациенты моложе 18 лет, пациенты, не способные или не желающие дать информированное согласие, пациенты, начавшие лечение адалимумабом менее чем через пять периодов полувыведения после прерывания предшествующей терапии анти-ФНО.

Размер выборки и статистика. Размер выборки рассчитывали на основе распределения и дисперсии основного результата, т. е. количества остеокластов, образовавшихся in vitro. Из популяции из 51 нормального донора в нашей лаборатории количество сгенерированных остеокластов составило 601,1 ± 156,8 остеокластов на лунку (данные представлены на ежегодном собрании Канадской ассоциации ревматологов в 2007 г., опубликованы в Journal of Rheumatology). Мы рассмотрели уровень значимости теста 5 % (α = 0,05) и мощность 80 % для выявления различий не менее чем в 100 остеокластов на лунку между группами (парный двусторонний t-критерий), что привело в общей сложности к 22 пациента. С учетом потери 10% по техническим причинам размер выборки был установлен в 25 пациентов.

Методология

Образцы крови: 50 мл крови в гепарине будут собирать у каждого пациента не более чем за 2 месяца до начала лечения адалимумабом и через 3 и шесть месяцев после первого введения препарата (± 2 недели). DAS-28, баллы HAQ, сопутствующие заболевания и сопутствующие лекарства будут определяться и записываться одновременно, а закодированные данные будут храниться в защищенной базе данных.

Исследования остеокластов:

Остеокластогенез: PBMC будут выделены из 50 мл крови с помощью градиента Ficoll-Hypaque, а количество предшественников CD14+ OC будет определено с помощью FACS. Всю популяцию РВМС помещают в 48-луночные планшеты для тканевых культур, содержащие срез кости или предметное стекло, и клеткам дают возможность дифференцироваться в течение 21 дня в присутствии рекомбинантного RANKL (75 нг/мл) и M- ЦСЖ (10 нг/мл). Затем клетки фиксируют и окрашивают на активность TRAP и гематоксилином. Количество клеток TRAP+, содержащих три или более ядер, подсчитывают в каждой лунке. Для каждого пациента будут использоваться три копии. В параллельных лунках клетки инкубируют в тех же условиях, но в присутствии адалимумаба в концентрации, сравнимой с концентрацией, обнаруживаемой in vivo после обработки.

Резорбтивная активность OC: Для анализа резорбции кости клетки, дифференцированные в течение 21 дня на срезах костей, будут окрашиваться для TRAP и 0,2% толуидинового синего. Площадь поверхности резорбции будет количественно определена с использованием программы анализа изображений Simple PCI. Параллельные анализы будут проводиться в присутствии адалимумаба.

Статистический анализ:

Группы до и после вмешательства будут сравниваться с использованием параметрических парных двусторонних тестов для переменных с нормальным распределением и непараметрических тестов, когда это уместно.

Ожидаемые результаты

Эти исследования позволят нам определить, влияет ли лечение адалимумабом на количество циркулирующих предшественников остеокластов, на образование остеокластов и на резорбционную активность этих клеток. Это также позволит определить, может ли адалимумаб в концентрациях, обнаруженных in vivo, оказывать прямое влияние на остеокластогенез человека и резорбцию кости. Возможно, что более важно, корреляция результатов остеокластов с изученными клиническими параметрами может позволить нам понять, может ли возможное воздействие на остеокласты коррелировать с клиническим ответом на лекарство, что указывает на возможный дополнительный механизм действия адалимумаба при ревматоидном артрите.