骨吸收、破骨细胞生成和阿达木单抗 (BROCA)

破骨细胞 (OC) 是专门从事骨降解的细胞，参与类风湿性关节炎 (RA) 中的骨和关节破坏。 实验模型已清楚地证明 OC 对于关节炎的局部骨吸收至关重要。 在 RANKL 敲除小鼠 (1; 2) 中，在接受 OPG (3-6) 的大鼠或在 c-fos (-/-) hTNF 转基因小鼠 (7) 中，关节炎的诱导导致炎症但不导致骨侵蚀。 系统性骨质疏松症是 RA 的重要合并症 (8; 9)。 OC 激活导致的全身骨吸收增加甚至发生在早期（< 2 岁）RA 中，并且与疾病活动度相关 (10)。 双膦酸盐可有效预防炎症性疾病引起的全身性骨质流失，但由于未知原因似乎不会影响关节周围骨质侵蚀和关节破坏。 最后，影响破骨细胞生成的全身性因素似乎存在于 RA 中，如与对照组相比，严重关节炎患者骨髓中 OCs 的形成增加 (11)。

TNF-α 是 RA 中的主要病理介质。 它可以直接诱导骨吸收，刺激破骨细胞生成 (12; 13) 或通过影响成骨细胞产生 RANKL、OPG 和前列腺素 (14; 15) 间接诱导骨吸收。 这些通路对于牙周炎、类风湿性关节炎和骨质疏松症等多种疾病的病理生理学可能很重要 (16; 17)。 在小鼠中，TNF-alpha 增加了体内破骨细胞前体的数量，但其作用可能更为复杂，并且还涉及破骨细胞生成抑制机制 (18; 19)；事实上，在某些情况下，TNF-α 可能会减少破骨细胞生成 (20)，因此可能很难从这些模型中预测阻断 TNF 的体内效果。

抗 TNF 剂可减少 RA 中的骨破坏，但尚不清楚这种效果是如何实现的，因为如前一段所述，TNF 已被证明对破骨细胞的形成和活性具有拮抗作用。 此外，抗 TNF 疗法对人类破骨细胞生物学的影响知之甚少。

工作假设

该项目基于两个不同但密切相关的假设：

1. 用抗 TNF 剂（在这种情况下为阿达木单抗）治疗可能会减少循环破骨细胞前体的数量、体外破骨细胞生成和体外骨吸收。
2. 将阿达木单抗添加到用于体外分化破骨细胞的培养基中可能会抑制破骨细胞生成和骨吸收。

目标

破骨细胞的骨吸收取决于产生破骨细胞的能力（破骨细胞生成）和个体破骨细胞的活性。 我们的目的是研究抗 TNF 治疗对 RA 患者外周血中破骨细胞前体数量的影响，以及对体外破骨细胞生成和破骨细胞活性的影响，该治疗在使用阿达木单抗治疗 RA 患者之前和期间进行。

研究计划

试验设计：作为一项旨在研究抗 TNF 治疗对破骨细胞生成和破骨细胞活性的影响的临床试验，我们将在治疗开始前和治疗开始后的两个时间点（3 个月和 6 个月）研究一组 RA 患者，以便每个患者将成为他/她自己的对照（研究前/后）。 引入治疗后需要两个时间点，原因有二：1) 对研究参数的最终影响可能达到峰值的时间尚不清楚，以及 2) 确保测量的参数随时间稳定。

结果：

主要结果将是阿达木单抗治疗前后（3 个月和 6 个月）以下参数的差异：

1. 外周血中破骨细胞前体 (CD14+) 细胞的数量
2. 体外产生的破骨细胞数量
3. 体外骨吸收量

次要结果：

1. 平行体外分化试验（产生的破骨细胞数量和骨吸收量）在外源性阿达木单抗存在的情况下，浓度范围在治疗患者的血浆中发现，以检测药物在体外对破骨细胞生成的直接影响。
2. 疾病活动定义为 DAS28 评分 (21; 22)
3. M-HAQ 功能状态的变化 (23)

患者队列：

纳入标准：患者满足 RA 的 ACR 标准 (24) 并已从舍布鲁克大学医院中心的风湿病学家处获得阿达木单抗处方。 接受过其他抗 TNF 疗法的患者仅在先前药物的 5 个半衰期后才有资格。 患者必须愿意签署知情同意书。 允许同时使用除抗 TNF 和其他生物制品以外的药物，治疗风湿病的医生可以根据患者的最佳利益对其进行调整。 因此，本研究对患者的常规治疗没有影响。 合并用药将被记录并在最终分析中予以考虑。

排除标准：18 岁以下或不能或不愿意提供知情同意的患者，在先前的抗 TNF 治疗中断后开始阿达木单抗少于五个半衰期的患者。

样本量和统计数据：样本量是根据主要结果的分布和方差计算的，即体外产生的破骨细胞的数量。 在我们实验室的 51 名正常供体中，产生的破骨细胞数量为 601.1 ± 156.8 个破骨细胞/孔（数据在加拿大风湿病学协会 2007 年年会上发表，在风湿病学杂志上发表）。 我们考虑了 5% (α = 0.05) 的检验显着性水平和 80% 的功效来检测组间至少 100 个破骨细胞/孔的差异（配对双尾 t 检验），这导致总共22 名患者。 考虑到由于技术原因导致 10% 的损失，样本量确定为 25 名患者。

方法

血样：在阿达木单抗治疗开始前不超过 2 个月以及首次给药后 3 个月和 6 个月（± 2 周），将从每位患者的肝素中采集 50 ml 血液。 DAS-28、HAQ 评分、合并症和合并用药将同时确定和记录，并将编码数据存储在安全数据库中。

破骨细胞研究：

破骨细胞生成：通过 Ficoll-Hypaque 梯度从 50 ml 血液中分离 PBMC，并通过 FACS 确定 CD14+ OC 前体的数量。 整个 PBMC 群体将接种在含有骨切片或载玻片的 48 孔组织培养板中，并且允许细胞在重组 RANKL (75 ng/ml) 和 M-脑脊液 (10 纳克/毫升)。 然后将细胞固定并用苏木精染色 TRAP 活性。 将计算每个孔中包含三个或更多核的 TRAP+ 细胞的数量。 每位患者将使用一式三份。 在平行孔中，细胞将在相同条件下孵育，但存在浓度与处理后体内发现的浓度相当的阿达木单抗。

OC 吸收活性：对于骨吸收测定，将在骨切片上分化 21 天的细胞进行 TRAP 和 0.2% 甲苯胺蓝染色。 吸收表面积将使用图像分析程序 Simple PCI 进行量化。 将在阿达木单抗存在下进行平行测定。

统计分析：

干预前后的组将使用参数配对双尾测试对具有正态分布的变量进行比较，并在适当时使用非参数测试。

预期结果

这些研究将使我们能够确定阿达木单抗治疗是否对循环破骨细胞前体的数量、破骨细胞的产生以及这些细胞的骨吸收活性有影响。 它还将允许确定阿达木单抗在体内发现的浓度是否可能对人类破骨细胞生成和骨吸收产生直接影响。 也许更重要的是，破骨细胞结果与研究的临床参数的相关性可能使我们了解对破骨细胞的最终影响是否可能与药物的临床反应相关，这表明阿达木单抗在类风湿性关节炎中可能存在额外的作用机制。