Kostní resorpce, osteoklastogeneze a adalimumab (BROCA)

Osteoklasty (OC) jsou buňky specializované na degradaci kostí, které se podílejí na destrukci kostí a kloubů u revmatoidní artritidy (RA). Experimentální modely jasně ukázaly, že OC jsou nezbytné pro lokální kostní resorpci u artritidy. U RANKL knockout myší (1; 2), u potkanů, kterým byl podáván OPG(3-6) nebo u c-fos(-/-) hTNF transgenních myší (7), indukce artritidy vede k zánětu, ale ne k erozi kostí. Systémová osteoporóza je důležitou komorbiditou u RA(8; 9). Zvýšená systémová kostní resorpce v důsledku aktivace OC se vyskytuje i u časné (< 2 roky) RA a koreluje s aktivitou onemocnění(10). Bisfosfonáty jsou účinné v prevenci systémové ztráty kostní hmoty u zánětlivých onemocnění, ale z neznámých důvodů se nezdá, že by ovlivňovaly periartikulární kostní erozi a destrukci kloubů. Konečně se zdá, že u RA je přítomen systémový faktor ovlivňující osteoklastogenezi, jak ukazuje zvýšená tvorba OC z kostní dřeně pacientů s těžkou artritidou ve srovnání s kontrolami (11).

TNF-alfa je hlavním patologickým mediátorem u RA. Může indukovat kostní resorpci buď přímo, stimulující osteoklastogenezi(12; 13), nebo nepřímo, ovlivněním produkce RANKL, OPG a prostaglandinů osteoblasty(14; 15). Tyto dráhy mohou být důležité pro patofyziologii několika onemocnění, jako je parodontitida, revmatoidní artritida a osteoporóza(16; 17). U myší TNF-alfa zvyšuje počet prekurzorů osteoklastů in vivo, ale jeho role může být složitější a může zahrnovat i mechanismy inhibující osteoklastogenezi(18; 19); ve skutečnosti za určitých podmínek může TNF-alfa snižovat osteoklastogenezi(20), takže in vivo účinek blokování TNF může být z těchto modelů obtížné předvídat.

Činidla anti-TNF snižují destrukci kosti u RA, ale není jasné, jak je tohoto účinku dosaženo, protože, jak je popsáno v předchozím odstavci, bylo prokázáno, že TNF má antagonistické účinky na tvorbu a aktivitu osteoklastů. Navíc je málo známo o účinku anti-TNF terapie na biologii osteoklastů u lidí.

Pracovní hypotéza

Tento projekt je založen na dvou různých, ale úzce souvisejících hypotézách:

1. Léčba anti-TNF látkami (v tomto případě Adalimumab) může snížit počet cirkulujících prekurzorů osteoklastů, in vitro osteoklastogenezi a in vitro kostní resorpci.
2. Přidání adalimumabu do kultivačního média používaného k diferenciaci osteoklastů in vitro může inhibovat osteoklastogenezi a kostní resorpci.

Cíle

Osteoklastická kostní resorpce závisí jak na schopnosti generovat osteoklasty (osteoklastogeneze), tak na individuální aktivitě osteoklastů. Naším cílem je studovat vliv anti-TNF terapie na počet prekurzorů osteoklastů v periferní krvi pacientů s RA, na in vitro osteoklastogenezi a na aktivitu osteoklastů před a během léčby pacientů s RA adalimumabem.

Výzkumný plán

Design studie: Jako klinická stezka zaměřená na studium vlivu anti-TNF léčby na osteoklastogenezi a aktivitu osteoklastů budeme studovat jednu kohortu pacientů s RA před a ve dvou bodech po zahájení terapie, 3 a 6 měsíců, takže každý pacient bude jeho/její vlastní kontrolou (před/po studii). Dva časové body po zavedení terapie jsou potřebné ze dvou důvodů: 1) Čas, kdy případný účinek na studované parametry může dosáhnout svého vrcholu, není znám a 2) Aby bylo zajištěno, že naměřené parametry jsou stabilní v čase.

výsledky:

Primárními výsledky budou rozdíl v následujících parametrech před a po léčbě adalimumabem (3 a 6 měsíců):

1. počet prekurzorových buněk osteoklastů (CD14+) v periferní krvi
2. počet osteoklastů generovaných in vitro
3. množství kostní resorpce in vitro

Sekundární výsledky:

1. Paralelní in vitro diferenciační testy (počet vytvořených osteoklastů a množství kostní resorpce) v přítomnosti exogenního adalimumabu v rozmezí koncentrací zjištěných v plazmě léčených pacientů k detekci přímého účinku léku in vitro na osteoklastogenezi.
2. aktivita onemocnění definovaná jako skóre DAS28 (21; 22)
3. Změna funkčního stavu ze strany M-HAQ (23)

Kohorta pacientů:

Kritéria pro zařazení: Pacienti splňující kritéria ACR pro RA(24) a kteří obdrželi předpis adalimumabu od revmatologa v Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Pacienti, kteří dostávali jiné anti-TNF terapie, jsou způsobilí pouze po 5 poločasech předchozí léčby. Pacienti musí být ochotni podepsat informovaný souhlas. Souběžná medikace jiná než anti-TNF a jiná biologická léčiva je povolena a ošetřující revmatolog ji může upravit podle nejlepšího zájmu pacientů. Tato studie tedy nemá žádný vliv na rutinní léčbu pacientů. Souběžná medikace bude zaznamenána a zvážena v konečné analýze.

Kritéria vyloučení: Pacienti mladší 18 let nebo pacienti, kteří nejsou schopni či ochotni poskytnout informovaný souhlas, pacienti začínající s adalimumabem méně než pět poločasů života po přerušení předchozí anti-TNF terapie.

Velikost vzorku a statistika: Velikost vzorku byla vypočtena na základě distribuce a rozptylu primárního výsledku, tj. počtu osteoklastů generovaných in vitro. Z populace 51 normálních dárců v naší laboratoři byl počet generovaných osteoklastů 601,1 ± 156,8 osteoklastů/jamka (údaje prezentované na výročním zasedání Kanadské revmatologické asociace v roce 2007, v tisku v Journal of Rheumatology). Zvažovali jsme hladinu významnosti testu 5 % (α = 0,05) a sílu 80 % k detekci rozdílu alespoň 100 osteoklastů/jamku mezi skupinami (párový dvoustranný t-test), což vedlo k celkovému 22 pacientů. Vzhledem k 10% ztrátě z technických důvodů byla velikost vzorku stanovena na 25 pacientů.

Metodologie

Vzorky krve: Každému pacientovi bude odebráno 50 ml krve v heparinu nejpozději 2 měsíce před zahájením léčby adalimumabem a 3 a šest měsíců po prvním podání léku (± 2 týdny). DAS-28, skóre HAQ, komorbidity a souběžná medikace budou stanoveny a zaznamenány ve stejnou dobu a kódovaná data budou uložena v zabezpečené databázi.

Osteoklastové studie:

Osteoklastogeneze: PBMC budou izolovány z 50 ml krve Ficoll-Hypaque gradientem a počet CD14+ OC prekurzorů bude stanoven pomocí FACS. Celá populace PBMC bude umístěna na 48jamkové tkáňové kultivační destičky obsahující kostní řez nebo skleněné podložní sklíčko a buňky budou ponechány diferencovat po dobu 21 dnů v přítomnosti rekombinantního RANKL (75 ng/ml) a M- CSF (10 ng/ml). Buňky jsou poté fixovány a obarveny na aktivitu TRAP a hematoxylinem. V každé jamce bude spočítán počet TRAP+ buněk obsahujících tři nebo více jader. Pro každého pacienta budou použity triplikáty. V paralelních jamkách budou buňky inkubovány za stejných podmínek, ale v přítomnosti adalimumabu v koncentraci srovnatelné s koncentrací zjištěnou in vivo po ošetření.

OC resorpční aktivita: Pro testy kostní resorpce budou buňky diferencované po dobu 21 dnů na kostních řezech obarveny na TRAP a 0,2 % toluidinovou modř. Plocha resorpčního povrchu bude kvantifikována pomocí programu pro analýzu obrazu Simple PCI. Paralelní testy budou provedeny v přítomnosti adalimumabu.

Statistická analýza:

Skupiny před a po intervenci budou porovnány pomocí parametrických párových dvoustranných testů pro proměnné s normálním rozdělením a případně s neparametrickými testy.

Očekávané výsledky

Tyto studie nám umožní určit, zda má léčba adalimumabem vliv na počet cirkulujících prekurzorů osteoklastů, na tvorbu osteoklastů a na kostní resorpční aktivitu těchto buněk. Umožní také určit, zda adalimumab v koncentracích zjištěných in vivo může mít přímý dopad na lidskou osteoklastogenezi a kostní resorpci. Možná ještě důležitější je, že korelace výsledků osteoklastů se studovanými klinickými parametry nám může umožnit pohled na to, zda případný účinek na osteoklasty může korelovat s klinickou odpovědí na medikaci, což ukazuje na možný další mechanismus účinku adalimumabu u revmatoidní artritidy.