Luun resorptio, osteoklastogeneesi ja adalimumabi (BROCA)

Osteoklastit (OC) ovat luun hajoamiseen erikoistuneita soluja, jotka osallistuvat luun ja nivelten tuhoutumiseen nivelreumassa (RA). Kokeelliset mallit ovat selvästi osoittaneet, että OC:t ovat välttämättömiä paikalliselle luun resorptiolle niveltulehduksessa. RANKL-poistohiirillä (1; 2), rotilla, jotka saavat OPG(3-6):ta, tai c-fos(-/-)-hTNF-siirtogeenisillä hiirillä (7) niveltulehduksen induktio johtaa tulehdukseen, mutta ei luun eroosioon. Systeeminen osteoporoosi on tärkeä rinnakkaissairaus nivelreumassa (8; 9). OC-aktivaatiosta johtuva lisääntynyt systeeminen luun resorptio tapahtuu jopa varhaisessa (< 2 vuotta) RA:ssa ja korreloi sairauden aktiivisuuden kanssa (10). Bisfosfonaatit ovat tehokkaita estämään systeemistä luukatoa tulehdussairauksissa, mutta tuntemattomista syistä ne eivät näytä vaikuttavan periartikulaariseen luun eroosioon ja nivelten tuhoutumiseen. Lopuksi nivelreumassa näyttää olevan osteoklastogeneesiin vaikuttava systeeminen tekijä, mikä näkyy lisääntyneenä OC:iden muodostumisena vaikeaa niveltulehdusta sairastavien potilaiden luuytimestä verrattuna kontrolleihin (11).

TNF-alfa on tärkein patologinen välittäjä nivelreumassa. Se voi indusoida luun resorptiota joko suoraan stimuloimalla osteoklastogeneesiä (12; 13) tai epäsuorasti vaikuttamalla osteoblastien RANKL:n, OPG:n ja prostaglandiinien tuotantoon (14; 15). Nämä reitit voivat olla tärkeitä useiden sairauksien, kuten parodontiitin, nivelreuman ja osteoporoosin, patofysiologialle (16; 17). Hiirillä TNF-alfa lisää osteoklastien esiasteiden määrää in vivo, mutta sen rooli voi kuitenkin olla monimutkaisempi ja sisältää myös osteoklastogeneesiä inhiboivia mekanismeja (18; 19); itse asiassa tietyissä olosuhteissa TNF-alfa voi vähentää osteoklastogeneesiä (20), joten TNF:n estämisen in vivo -vaikutusta voi olla vaikea ennustaa näistä malleista.

Anti-TNF-aineet vähentävät luun tuhoutumista nivelreumassa, mutta ei ole selvää, kuinka tämä vaikutus saavutetaan, koska, kuten edellisessä kappaleessa on kuvattu, TNF:llä on osoitettu olevan antagonistisia vaikutuksia osteoklastien muodostumiseen ja aktiivisuuteen. Lisäksi tiedetään vähän anti-TNF-hoidon vaikutuksesta osteoklastibiologiaan ihmisillä.

Työhypoteesi

Tämä projekti perustuu kahteen erilaiseen, mutta läheisesti liittyvään hypoteesiin:

1. Hoito anti-TNF-aineilla (tässä tapauksessa adalimumabi) voi vähentää kiertävien osteoklastien esiasteiden määrää, in vitro osteoklastogeneesiä ja in vitro luun resorptiota.
2. Adalimumabin lisääminen elatusaineeseen, jota käytetään osteoklastien erottamiseen in vitro, voi estää osteoklastogeneesiä ja luun resorptiota.

Tavoitteet

Osteoklastinen luun resorptio riippuu sekä kyvystä tuottaa osteoklasteja (osteoklastogeneesi) että yksittäisten osteoklastien aktiivisuudesta. Tavoitteenamme on tutkia anti-TNF-hoidon vaikutusta osteoklastien esiasteiden määrään nivelreumapotilaiden perifeerisessä veressä, in vitro osteoklastogeneesiin ja osteoklastien aktiivisuuteen ennen nivelreumapotilaiden adalimumabihoitoa ja sen aikana.

Tutkimussuunnitelma

Kokeen suunnittelu: Kliinisenä polkuna, jonka tarkoituksena on tutkia anti-TNF-hoidon vaikutusta osteoklastogeneesiin ja osteoklastien aktiivisuuteen, tutkimme yhtä nivelreumapotilaiden kohorttia ennen ja kahdessa vaiheessa hoidon aloittamisen jälkeen, 3 ja 6 kuukautta, jotta jokainen potilas on hänen oma kontrollinsa (ennen/jälkeen). Kaksi aikapistettä hoidon aloittamisen jälkeen ovat tarpeen kahdesta syystä: 1) Aikaa, jolloin mahdollinen vaikutus tutkittuihin parametreihin saattaa saavuttaa huippunsa, ei tiedetä ja 2) sen varmistamiseksi, että mitatut parametrit ovat vakaat ajan myötä.

Tulokset:

Ensisijaiset tulokset ovat ero seuraavissa parametreissa ennen ja jälkeen adalimumabihoidon (3 ja 6 kuukautta):

1. osteoklastien esiastesolujen (CD14+) lukumäärä perifeerisessä veressä
2. in vitro muodostuneiden osteoklastien lukumäärä
3. luun resorption määrä in vitro

Toissijaiset tulokset:

1. Rinnakkaiset in vitro -erilaistumismääritykset (syntyneiden osteoklastien lukumäärä ja luun resorption määrä) eksogeenisen adalimumabin läsnä ollessa hoidettujen potilaiden plasmasta löydetyllä pitoisuusalueella lääkkeen suoran vaikutuksen havaitsemiseksi in vitro osteoklastogeneesissä.
2. sairauden aktiivisuus määritelty DAS28-pisteinä (21; 22)
3. M-HAQ:n toimintatilan muutos (23)

Potilasryhmä:

Sisällyttämiskriteerit: Potilaat, jotka täyttävät RA:n ACR-kriteerit(24) ja jotka ovat saaneet adalimumabireseptin Center Hospitalier universitaire de Sherbrooken reumatologilta. Potilaat, jotka ovat saaneet muita anti-TNF-hoitoja, ovat kelpoisia vasta 5 edellisen lääkkeen puoliintumisajan jälkeen. Potilaiden on oltava valmiita allekirjoittamaan tietoinen suostumus. Muiden kuin anti-TNF-lääkkeiden ja muiden biologisten lääkkeiden samanaikainen käyttö on sallittua, ja hoitava reumatologi voi säätää niitä potilaan edun mukaisesti. Tällä tutkimuksella ei siten ole vaikutusta potilaiden rutiinihoitoon. Samanaikainen lääkitys kirjataan ja otetaan huomioon loppuanalyysissä.

Poissulkemiskriteerit: Alle 18-vuotiaat potilaat, jotka eivät pysty tai halua antaa tietoon perustuvaa suostumusta, potilaat, joiden adalimumabihoito alkaa alle viisi puoliintumisaikaa aiemman anti-TNF-hoidon keskeyttämisen jälkeen.

Otoskoko ja tilastot: Otoskoko laskettiin ensisijaisen tuloksen jakautumisen ja varianssin perusteella, eli in vitro syntyneiden osteoklastien lukumäärän perusteella. Laboratoriomme 51 normaalin luovuttajan populaatiosta syntyneiden osteoklastien määrä oli 601,1 ± 156,8 osteoklastia/kuoppa (tiedot esiteltiin Canadian Rheumatology Associationin vuoden 2007 vuosikokouksessa, julkaistu Journal of Rheumatology -lehdessä). Tarkastelimme testin merkitsevyystasoa 5 % (α = 0,05) ja 80 %:n kykyä havaita vähintään 100 osteoklastin/kuoppa ero ryhmien välillä (parillinen kaksisuuntainen t-testi), mikä johti yhteensä 22 potilasta. Ottaen huomioon teknisistä syistä johtuvan 10 %:n tappion, otoskooksi vahvistettiin 25 potilasta.

Metodologia

Verinäytteet: Jokaiselta potilaalta otetaan 50 ml hepariinia sisältävää verta enintään 2 kuukautta ennen adalimumabihoidon aloittamista ja 3 ja kuusi kuukautta lääkkeen ensimmäisen annon jälkeen (± 2 viikkoa). DAS-28, HAQ-pisteet, liitännäissairaudet ja samanaikainen lääkitys määritetään ja kirjataan samaan aikaan ja koodatut tiedot tallennetaan suojattuun tietokantaan.

Osteoklastitutkimukset:

Osteoklastogeneesi: PBMC:t eristetään 50 ml:sta verta Ficoll-Hypaque-gradientilla ja CD14+ OC-prekursorien lukumäärä määritetään FACS:lla. Koko PBMC-populaatio maljataan 48-kuoppaisille kudosviljelylevyille, jotka sisältävät luuviipaleen tai lasilevyn, ja solujen annetaan erilaistua 21 päivän ajan rekombinantin RANKL:n (75 ng/ml) ja M- CSF (10 ng/ml). Sitten solut kiinnitetään ja värjätään TRAP-aktiivisuuden ja hematoksyliinin suhteen. Kolme tai useampia tumia sisältävien TRAP+-solujen lukumäärä lasketaan kussakin kuopassa. Jokaiselle potilaalle käytetään kolmea kappaletta. Rinnakkaisissa kuopissa soluja inkuboidaan samoissa olosuhteissa, mutta adalimumabin läsnä ollessa pitoisuudessa, joka on verrattavissa in vivo käsittelyn jälkeen havaittuun pitoisuuteen.

OC-resorptiivinen aktiivisuus: Luun resorptiomäärityksiä varten solut, jotka ovat erilaistuneet 21 päivän ajan luuviipaleilla, värjätään TRAP:n ja 0,2 % toluidiinisinisen suhteen. Resorption pinta-ala kvantifioidaan käyttämällä Simple PCI -kuva-analyysiohjelmaa. Parellel-analyysit tehdään adalimumabin läsnä ollessa.

Tilastollinen analyysi:

Interventiota edeltäviä ja sen jälkeen olevia ryhmiä verrataan käyttämällä parametrisia parillisia kaksisuuntaisia ​​testejä muuttujille, joilla on normaalijakauma, ja tarvittaessa ei-parametrisilla testeillä.

Odotetut tulokset

Näiden tutkimusten avulla voimme määrittää, vaikuttaako adalimumabihoito verenkierrossa olevien osteoklastien esiasteiden määrään, osteoklastien muodostumiseen ja näiden solujen luuta resorboivaan aktiivisuuteen. Sen avulla voidaan myös määrittää, voiko adalimumabilla in vivo havaittuina pitoisuuksina olla suora vaikutus ihmisen osteoklastogeneesiin ja luun resorptioon. Ehkä vielä tärkeämpää on, että osteoklastien tulosten korrelaatio tutkittujen kliinisten parametrien kanssa voi antaa meille käsityksen siitä, voiko mahdollinen vaikutus osteoklasteihin korreloida lääkkeen kliinisen vasteen kanssa, mikä osoittaa adalimumabin mahdollisen lisävaikutusmekanismin nivelreumassa.