Benresorption, osteoklastogenes och Adalimumab (BROCA)

Osteoklaster (OCs) är celler specialiserade på bennedbrytning som deltar i ben- och ledförstöring vid reumatoid artrit (RA). Experimentella modeller har tydligt visat att OC är avgörande för lokal benresorption vid artrit. Hos RANKL knockout-möss(1; 2), hos råttor som får OPG(3-6) eller i c-fos(-/-) hTNF-transgena möss(7) leder induktion av artrit till inflammation men inte till benerosion. Systemisk osteoporos är en viktig komorbiditet vid RA(8; 9). Ökad systemisk benresorption på grund av OC-aktivering inträffar även i tidig (< 2 år) RA och korrelerar med sjukdomsaktivitet(10). Bisfosfonater är effektiva för att förhindra systemisk benförlust vid inflammatoriska sjukdomar, men verkar av okända orsaker inte påverka periartikulär benerosion och ledförstöring. Slutligen tycks en systemisk faktor som påverkar osteoklastogenes vara närvarande vid RA, vilket visas av en ökad bildning av OC från benmärg hos patienter med svår artrit jämfört med kontroller(11).

TNF-alfa är en viktig patologisk mediator vid RA. Det kan inducera benresorption antingen direkt, stimulerande osteoklastogenes(12; 13) eller indirekt, genom att påverka RANKL, OPG och prostaglandinproduktion av osteoblaster(14; 15). Dessa vägar kan vara viktiga för patofysiologin för flera sjukdomar som parodontit, reumatoid artrit och osteoporos(16; 17). Hos möss ökar TNF-alfa antalet osteoklastprekursorer in vivo men dess roll kan dock vara mer komplex och implicera även osteoklastogenes-hämmande mekanismer(18; 19); i själva verket, under vissa förhållanden, kan TNF-alfa minska osteoklastogenes(20), så in vivo-effekten av att blockera TNF kan vara svår att förutsäga från dessa modeller.

Anti-TNF-medel minskar bendestruktion vid RA men det är inte klart hur denna effekt uppnås eftersom TNF har visat sig ha antagonistiska effekter på osteoklastbildning och aktivitet, som beskrivs i föregående stycke. Dessutom är lite känt om effekten av anti-TNF-terapi på osteoklastbiologi hos människor.

Arbetshypotes

Detta projekt bygger på två olika men närbesläktade hypoteser:

1. Behandling med anti-TNF-medel (Adalimumab i detta fall) kan minska antalet cirkulerande osteoklastprekursorer, in vitro osteoklastogenes och in vitro benresorption.
2. Tillsats av Adalimumab till odlingsmediet som används för att differentiera osteoklaster in vitro kan hämma osteoklastogenes och benresorption.

Mål

Osteoklastisk benresorption beror på både förmågan att generera osteoklaster (osteoklastogenes) och på individuell osteoklastaktivitet. Vårt mål är att studera effekten av anti-TNF-terapi på antalet osteoklastprekursorer i det perifera blodet hos patienter med RA, på osteoklastogenes in vitro och på osteoklastaktivitet före och under behandlingen av patienter med RA med Adalimumab.

Forskningsplan

Försöksdesign: Som ett kliniskt spår som syftar till att studera effekten av anti-TNF-behandling på osteoklastogenes och osteoklastaktivitet kommer vi att studera en kohort patienter med RA före och vid två punkter efter behandlingens början, 3 och 6 månader, så att varje patienten kommer att vara hans/hennes egen kontroll (före/efter studien). De två tidpunkterna efter införandet av behandlingen behövs av två skäl: 1) Tidpunkten när en eventuell effekt på de studerade parametrarna kan nå sin topp är inte känd och 2) För att säkerställa att de uppmätta parametrarna är stabila över tiden.

Resultat:

Primära utfall kommer att vara skillnaden i följande parametrar före och efter behandling med Adalimumab (3 och 6 månader):

1. antalet osteoklastprekursorceller (CD14+) i det perifera blodet
2. antalet osteoklaster som genereras in vitro
3. mängden benresorption in vitro

Sekundära resultat:

1. Parallella in vitro differentieringsanalyser (antal genererade osteoklaster och mängd benresorption) i närvaro av exogent Adalimumab i koncentrationsintervallet som finns i plasma från behandlade patienter för att upptäcka en direkt effekt av medicinen in vitro vid osteoklastogenes.
2. sjukdomsaktivitet definierad som en DAS28-poäng (21; 22)
3. Ändring av funktionsstatus av M-HAQ (23)

Patientkohort:

Inklusionskriterier: Patienter som uppfyller ACR-kriterierna för RA(24) och som har fått ett recept på Adalimumab från en reumatolog vid Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Patienter som har fått andra anti-TNF-terapier är berättigade först efter 5 halveringstider av den tidigare medicineringen. Patienter måste vara villiga att skriva under ett informerat samtycke. Samtidig medicinering förutom anti-TNF och andra biologiska läkemedel är tillåten och den behandlande reumatologen kan anpassa det efter patienternas bästa. Denna studie har således ingen inverkan på den rutinmässiga behandlingen av patienterna. Samtidig medicinering kommer att registreras och övervägas i den slutliga analysen.

Uteslutningskriterier: Patienter under 18 år eller som inte kan eller vill ge informerat samtycke, patienter som börjar med Adalimumab mindre än fem halveringstider efter avbrott i en tidigare anti-TNF-behandling.

Provstorlek och statistik: Provstorleken beräknades baserat på fördelningen och variansen av det primära resultatet, det vill säga antalet osteoklaster genererade in vitro. Från en population på 51 normala donatorer i vårt laboratorium var antalet genererade osteoklaster 601,1 ± 156,8 osteoklaster/brunn (data presenterade vid 2007 års årliga möte för Canadian Rheumatology Association, i press på Journal of Rheumatology). Vi ansåg en testsignifikansnivå på 5 % (α = 0,05) och kraften på 80 % för att upptäcka en skillnad på minst 100 osteoklaster/brunn mellan grupperna (parat tvåsidigt t-test), vilket ledde till totalt 22 patienter. Med tanke på en förlust på 10 % på grund av tekniska skäl fastställdes urvalsstorleken till 25 patienter.

Metodik

Blodprover: 50 ml blod i heparin kommer att tas från varje patient högst 2 månader innan behandlingen med Adalimumab påbörjas och 3 och sex månader efter den första administreringen av läkemedlet (± 2 veckor). DAS-28, HAQ-poäng, samsjukligheter och samtidig medicinering kommer att bestämmas och registreras vid samma tidpunkter och kodad data lagras i en säker databas.

Osteoklaststudier:

Osteoklastogenes: PBMCs kommer att isoleras från 50 ml blod genom Ficoll-Hypaque-gradient och antalet CD14+ OC-prekursorer kommer att bestämmas av FACS. Hela populationen av PBMC:er kommer att strökas ut i vävnadsodlingsplattor med 48 brunnar innehållande en benskiva eller ett objektglas, och cellerna kommer att tillåtas att differentiera i 21 dagar i närvaro av rekombinant RANKL (75 ng/ml) och M- CSF (10 ng/ml). Cellerna fixeras sedan och färgas för TRAP-aktivitet och med hematoxylin. Antalet TRAP+-celler som innehåller tre eller fler kärnor kommer att räknas i varje brunn. Tre exemplar kommer att användas för varje patient. I parallella brunnar kommer cellerna att inkuberas under samma förhållanden men i närvaro av Adalimumab i en koncentration som är jämförbar med den som finns in vivo efter behandling.

OC-resorptiv aktivitet: För benresorptionsanalyser kommer celler differentierade under 21 dagar på benskivor att färgas för TRAP och 0,2 % toluidinblått. Resorptionsytan kommer att kvantifieras med hjälp av bildanalysprogrammet, Simple PCI. Parellella analyser kommer att göras i närvaro av Adalimumab.

Statistisk analys:

Grupperna före och efter intervention kommer att jämföras med parametriska parade tvåsidiga test för variablerna med normalfördelning och med icke-parametriska tester när så är lämpligt.

Förväntade resultat

Dessa studier kommer att göra det möjligt för oss att avgöra om behandling med Adalimumab har en effekt på antalet cirkulerande osteoklastprekursorer, på genereringen av osteoklaster och på dessa cellers benresorberande aktivitet. Det kommer också att göra det möjligt att avgöra om Adalimumab, i koncentrationer som hittas in vivo, kan ha en direkt inverkan på mänsklig osteoklastogenes och benresorption. Kanske ännu viktigare, korrelation av osteoklastresultaten med de studerade kliniska parametrarna kan ge oss en insikt om huruvida en eventuell effekt på osteoklaster kan korrelera med det kliniska svaret på medicinen, vilket indikerar en möjlig ytterligare verkningsmekanism för Adalimumab vid reumatoid artrit.