Benresorpsjon, osteoklastogenese og Adalimumab (BROCA)

Osteoklaster (OCs) er celler spesialiserte i bennedbrytning som deltar i bein- og leddødeleggelse ved revmatoid artritt (RA). Eksperimentelle modeller har tydelig vist at OC er avgjørende for lokal benresorpsjon ved leddgikt. Hos RANKL knockout-mus(1; 2), hos rotter som mottar OPG(3-6) eller i c-fos(-/-) hTNF-transgene mus(7) fører induksjon av leddgikt til betennelse, men ikke til beinerosjon. Systemisk osteoporose er en viktig komorbiditet ved RA(8; 9). Økt systemisk benresorpsjon på grunn av OC-aktivering forekommer selv i tidlig (< 2 år) RA og korrelerer med sykdomsaktivitet(10). Bisfosfonater er effektive for å forhindre systemisk bentap ved inflammatoriske sykdommer, men ser av ukjente årsaker ikke ut til å påvirke periartikulær benerosjon og leddødeleggelse. Til slutt ser det ut til at en systemisk faktor som påvirker osteoklastogenese er tilstede ved RA, som vist ved økt dannelse av OCs fra benmarg hos pasienter med alvorlig artritt sammenlignet med kontroller (11).

TNF-alfa er en viktig patologisk mediator ved RA. Det kan indusere benresorpsjon enten direkte, stimulerende osteoklastogenese(12; 13) eller indirekte, ved å påvirke RANKL, OPG og prostaglandinproduksjon av osteoblaster(14; 15). Disse veiene kan være viktige for patofysiologien til flere sykdommer som periodontitt, revmatoid artritt og osteoporose(16; 17). Hos mus øker TNF-alfa antallet osteoklastforløpere in vivo, men dens rolle kan imidlertid være mer kompleks og implisere også osteoklastogenese-hemmende mekanismer (18; 19); faktisk, under visse forhold, kan TNF-alfa redusere osteoklastogenese(20), så in vivo-effekten av blokkering av TNF kan være vanskelig å forutsi fra disse modellene.

Anti-TNF-midler reduserer beinødeleggelse ved RA, men det er ikke klart hvordan denne effekten oppnås siden, som beskrevet i forrige avsnitt, har TNF vist seg å ha antagonistiske effekter i osteoklastdannelse og -aktivitet. Dessuten er lite kjent om effekten av anti-TNF-terapi på osteoklastbiologi hos mennesker.

Arbeidshypotese

Dette prosjektet er basert på to forskjellige, men nært beslektede hypoteser:

1. Behandling med anti-TNF-midler (Adalimumab i dette tilfellet) kan redusere antall sirkulerende osteoklastforløpere, in vitro osteoklastogenese og in vitro benresorpsjon.
2. Tilsetning av Adalimumab til kulturmediet som brukes for å differensiere osteoklaster in vitro kan hemme osteoklastogenese og benresorpsjon.

Mål

Osteoklastisk benresorpsjon avhenger både av kapasiteten til å generere osteoklaster (osteoklastogenese) og av individuell osteoklastaktivitet. Vårt mål er å studere effekten av anti-TNF-behandling på antall osteoklastforløpere i det perifere blodet til pasienter med RA, på in vitro osteoklastogenese og på osteoklastaktivitet før og under behandling av pasienter med RA med Adalimumab.

Forskningsplan

Forsøksdesign: Som et klinisk spor rettet mot å studere effekten av anti-TNF-behandling på osteoklastogenese og osteoklastaktivitet, vil vi studere en kohort av pasienter med RA før og på to tidspunkter etter begynnelsen av behandlingen, 3 og 6 måneder, slik at hver pasienten vil være hans/hennes egen kontroll (før/etter studien). De to tidspunktene etter introduksjon av terapien er nødvendig av to grunner: 1) Tidspunktet når en eventuell effekt på de studerte parametrene kan nå toppen er ikke kjent og 2) For å sikre at de målte parametrene er stabile over tid.

Utfall:

Primære utfall vil være forskjellen i følgende parametere før og etter behandling med Adalimumab (3 og 6 måneder):

1. antall osteoklastforløperceller (CD14+) i det perifere blodet
2. antall osteoklaster generert in vitro
3. mengden benresorpsjon in vitro

Sekundære utfall:

1. Parallelle in vitro differensieringsanalyser (antall osteoklaster generert og mengde benresorpsjon) i nærvær av eksogent Adalimumab i konsentrasjonsområdet funnet i plasma fra behandlede pasienter for å påvise en direkte effekt av medisinen in vitro i osteoklastogenese.
2. sykdomsaktivitet definert som en DAS28-score (21; 22)
3. Endring i funksjonsstatus av M-HAQ (23)

Pasientkohort:

Inklusjonskriterier: Pasienter som tilfredsstiller ACR-kriteriene for RA(24) og som har mottatt en resept på Adalimumab fra en revmatolog ved Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Pasienter som har mottatt andre anti-TNF-behandlinger er kun kvalifisert etter 5 halveringstider av den forrige medisinen. Pasienter må være villige til å signere et informert samtykke. Samtidig medisinering annet enn anti-TNF og andre biologiske midler er tillatt, og den behandlende revmatologen kan justere det etter pasientens beste. Denne studien har derfor ingen innvirkning på den rutinemessige behandlingen av pasientene. Samtidig medisinering vil bli registrert og vurdert i den endelige analysen.

Eksklusjonskriterier: Pasienter under 18 år eller ikke i stand til eller villige til å gi informert samtykke, pasienter som starter med Adalimumab mindre enn fem halveringstider etter avbrudd av en tidligere anti-TNF-behandling.

Prøvestørrelse og statistikk: Prøvestørrelsen ble beregnet basert på fordelingen og variansen til det primære resultatet, det vil si antall osteoklaster generert in vitro. Fra en populasjon på 51 normale donorer i laboratoriet vårt var antallet genererte osteoklaster 601,1 ± 156,8 osteoklaster/brønn (data presentert på årsmøtet i 2007 til Canadian Rheumatology Association, under trykk i Journal of Rheumatology). Vi vurderte et testsignifikansnivå på 5 % (α = 0,05) og kraften på 80 % for å oppdage en forskjell på minst 100 osteoklaster/brønn mellom gruppene (paret to-halet t-test), noe som førte til totalt 22 pasienter. Tatt i betraktning et tap på 10 % på grunn av tekniske årsaker ble prøvestørrelsen fastslått til 25 pasienter.

Metodikk

Blodprøver: 50 ml blod i heparin vil bli tatt fra hver pasient ikke mer enn 2 måneder før behandlingsstart med Adalimumab og 3 og seks måneder etter første administrasjon av legemidlet (± 2 uker). DAS-28, HAQ-skåre, komorbiditeter og samtidig medisinering vil bli bestemt og registrert på samme tidspunkt og de kodede dataene lagres i en sikker database.

Osteoklaststudier:

Osteoklastogenese: PBMC-er vil bli isolert fra 50 ml blod ved Ficoll-Hypaque-gradient og antall CD14+ OC-forløpere vil bli bestemt av FACS. Hele populasjonen av PBMC-er vil bli belagt i 48-brønners vevskulturplater som inneholder en beinskive eller et glassglass, og cellene vil få lov til å differensiere i 21 dager i nærvær av rekombinant RANKL (75 ng/ml) og M- CSF (10 ng/ml). Cellene fikseres deretter og farges for TRAP-aktivitet og med hematoksylin. Antall TRAP+-celler som inneholder tre eller flere kjerner vil telles i hver brønn. Triplikater vil bli brukt for hver pasient. I parallelle brønner vil cellene bli inkubert under de samme forholdene, men i nærvær av Adalimumab i konsentrasjon som kan sammenlignes med den som finnes in vivo etter behandling.

OC-resorptiv aktivitet: For benresorpsjonsanalyser vil celler differensiert i 21 dager på benskiver farges for TRAP og 0,2 % toluidinblått. Resorpsjonsoverflatearealet vil kvantifiseres ved hjelp av bildeanalyseprogrammet, Simple PCI. Parallelle analyser vil bli utført i nærvær av Adalimumab.

Statistisk analyse:

Gruppene før og etter intervensjon vil bli sammenlignet med parametriske parede to-halede tester for variablene med normalfordeling og med ikke-parametriske tester når det er hensiktsmessig.

Forventede resultater

Disse studiene vil tillate oss å avgjøre om behandling med Adalimumab har en effekt på antall sirkulerende osteoklastforløpere, på dannelsen av osteoklaster og på den benresorberende aktiviteten til disse cellene. Det vil også gjøre det mulig å bestemme om Adalimumab, i konsentrasjoner funnet in vivo, kan ha en direkte innvirkning på human osteoklastogenese og benresorpsjon. Kanskje enda viktigere, korrelasjon av osteoklastresultatene med de kliniske parameterne som er studert kan gi oss en innsikt i hvorvidt en eventuell effekt på osteoklaster kan korrelere med den kliniske responsen på medisinen, noe som indikerer en mulig ytterligere virkningsmekanisme for Adalimumab ved revmatoid artritt.