Reabsorção Óssea, Osteoclastogênese e Adalimumabe (BROCA)

Osteoclastos (OCs) são células especializadas na degradação óssea que participam da destruição óssea e articular na Artrite Reumatoide (AR). Modelos experimentais demonstraram claramente que os COs são essenciais para a reabsorção óssea local na artrite. Em camundongos knockout para RANKL (1; 2), em ratos recebendo OPG (3-6) ou em camundongos transgênicos c-fos (-/-) hTNF (7), a indução de artrite leva à inflamação, mas não à erosão óssea. A osteoporose sistêmica é uma comorbidade importante na AR(8; 9). O aumento da reabsorção óssea sistêmica devido à ativação de OC ocorre mesmo na AR inicial (< 2 anos) e se correlaciona com a atividade da doença(10). Os bisfosfonatos são eficazes na prevenção da perda óssea sistêmica em doenças inflamatórias, mas, por razões desconhecidas, não parecem influenciar a erosão óssea periarticular e a destruição articular. Por fim, um fator sistêmico que afeta a osteoclastogênese parece estar presente na AR, como demonstrado por uma formação aumentada de COs da medula óssea de pacientes com artrite grave quando comparados aos controles(11).

O TNF-alfa é um importante mediador patológico na AR. Pode induzir a reabsorção óssea diretamente, estimulando a osteoclastogênese(12; 13) ou indiretamente, influenciando a produção de RANKL, OPG e prostaglandinas pelos osteoblastos(14; 15). Essas vias podem ser importantes para a fisiopatologia de diversas doenças como periodontite, artrite reumatóide e osteoporose(16; 17). Em camundongos, o TNF-alfa aumenta o número de precursores de osteoclastos in vivo, mas seu papel pode, no entanto, ser mais complexo e implicar também mecanismos de inibição da osteoclastogênese (18; 19); de fato, em certas condições, o TNF-alfa pode diminuir a osteoclastogênese(20), então o efeito in vivo do bloqueio do TNF pode ser difícil de prever a partir desses modelos.

Os agentes anti-TNF reduzem a destruição óssea na AR, mas não está claro como esse efeito é alcançado, pois, conforme descrito no parágrafo anterior, o TNF demonstrou ter efeitos antagonistas na formação e atividade dos osteoclastos. Além disso, pouco se sabe sobre o efeito da terapia anti-TNF na biologia dos osteoclastos em humanos.

hipótese de trabalho

Este projeto é baseado em duas hipóteses diferentes, mas intimamente relacionadas:

1. O tratamento com agentes anti-TNF (Adalimumabe neste caso) pode reduzir o número de precursores de osteoclastos circulantes, a osteoclastogênese in vitro e a reabsorção óssea in vitro.
2. A adição de Adalimumabe ao meio de cultura usado para diferenciar os osteoclastos in vitro pode inibir a osteoclastogênese e a reabsorção óssea.

Objetivos

A reabsorção óssea osteoclástica depende tanto da capacidade de gerar osteoclastos (osteoclastogênese) quanto da atividade individual dos osteoclastos. Nosso objetivo é estudar o efeito da terapia anti-TNF no número de precursores de osteoclastos no sangue periférico de pacientes com AR, na osteoclastogênese in vitro e na atividade dos osteoclastos antes e durante o tratamento de pacientes com AR com Adalimumabe.

Plano de pesquisa

Desenho do ensaio: Como uma trilha clínica destinada a estudar o impacto do tratamento anti-TNF na osteoclastogênese e na atividade dos osteoclastos, estudaremos uma coorte de pacientes com AR antes e em dois momentos após o início da terapia, 3 e 6 meses, para que cada paciente será seu próprio controle (antes/depois do estudo). Os dois momentos após a introdução da terapia são necessários por dois motivos: 1) Não se conhece o tempo em que um eventual efeito sobre os parâmetros estudados pode atingir seu pico e 2) Para garantir que os parâmetros medidos sejam estáveis ​​ao longo do tempo.

Resultados:

Os resultados primários serão a diferença nos seguintes parâmetros antes e depois do tratamento com Adalimumabe (3 e 6 meses):

1. o número de células precursoras de osteoclastos (CD14+) no sangue periférico
2. o número de osteoclastos gerados in vitro
3. a quantidade de reabsorção óssea in vitro

Resultados secundários:

1. Ensaios paralelos de diferenciação in vitro (número de osteoclastos gerados e quantidade de reabsorção óssea) na presença de Adalimumabe exógeno na faixa de concentração encontrada no plasma de pacientes tratados para detectar um efeito direto da medicação in vitro na osteoclastogênese.
2. atividade da doença definida como uma pontuação DAS28 (21; 22)
3. Alteração do estado funcional pelo M-HAQ (23)

Coorte de pacientes:

Critérios de inclusão: Pacientes que satisfizessem os Critérios ACR para AR(24) e tivessem recebido uma prescrição de Adalimumabe de um reumatologista do Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Pacientes que receberam outras terapias anti-TNF são elegíveis somente após 5 meias-vidas da medicação anterior. Os pacientes devem estar dispostos a assinar um consentimento informado. A medicação concomitante, exceto anti-TNFs e outros biológicos, é permitida e o reumatologista responsável pode ajustá-la de acordo com os interesses dos pacientes. Este estudo não tem, portanto, impacto na rotina de tratamento dos pacientes. A medicação concomitante será registrada e considerada na análise final.

Critérios de exclusão: Pacientes com menos de 18 anos ou incapazes ou não dispostos a fornecer consentimento informado, pacientes iniciando Adalimumabe com menos de cinco meias-vidas após a interrupção de uma terapia anti-TNF anterior.

Tamanho da amostra e estatísticas: O tamanho da amostra foi calculado com base na distribuição e variância do resultado primário, ou seja, o número de osteoclastos gerados in vitro. De uma população de 51 doadores normais em nosso laboratório, o número de osteoclastos gerados foi de 601,1 ± 156,8 osteoclastos/poço (dados apresentados na reunião anual de 2007 da Associação Canadense de Reumatologia, no prelo no Journal of Rheumatology). Consideramos um nível de significância de teste de 5% (α = 0,05) e o poder de 80% para detectar uma diferença de pelo menos 100 osteoclastos/poço entre os grupos (teste t bicaudal pareado), o que levou a um total de 22 pacientes. Considerando uma perda de 10% por motivos técnicos, o tamanho da amostra foi estabelecido em 25 pacientes.

Metodologia

Amostras de sangue: serão coletados 50 ml de sangue em heparina de cada paciente no máximo 2 meses antes do início do tratamento com Adalimumabe e 3 e 6 meses após a primeira administração do medicamento (± 2 semanas). DAS-28, escores HAQ, comorbidades e medicação concomitante serão determinados e registrados ao mesmo tempo e os dados codificados armazenados em um banco de dados seguro.

Estudos de Osteoclastos:

Osteoclastogênese: PBMCs serão isoladas de 50 ml de sangue por gradiente Ficoll-Hypaque e o número de precursores CD14+ OC será determinado por FACS. Toda a população de PBMCs será semeada em placas de cultura de tecidos de 48 poços contendo uma fatia de osso ou uma lâmina de vidro, e as células serão diferenciadas por 21 dias na presença de RANKL recombinante (75 ng/ml) e M- LCR (10 ng/ml). As células são então fixadas e coradas para atividade TRAP e com hematoxilina. O número de células TRAP+ contendo três ou mais núcleos será contado em cada poço. Triplicatas serão usadas para cada paciente. Em poços paralelos as células serão incubadas nas mesmas condições, porém na presença de Adalimumabe em concentração comparável à encontrada in vivo após o tratamento.

Atividade de reabsorção OC: Para ensaios de reabsorção óssea, células diferenciadas por 21 dias em fatias ósseas serão coradas para TRAP e 0,2% de azul de toluidina. A área da superfície de reabsorção será quantificada utilizando o programa de análise de imagens, Simple PCI. Ensaios paralelos serão feitos na presença de Adalimumabe.

Análise estatística:

Os grupos antes e depois da intervenção serão comparados por meio de testes paramétricos bicaudais pareados para as variáveis ​​com distribuição normal e com testes não paramétricos quando apropriado.

Resultados antecipados

Esses estudos permitirão determinar se o tratamento com Adalimumabe tem efeito no número de precursores de osteoclastos circulantes, na geração de osteoclastos e na atividade de reabsorção óssea dessas células. Também permitirá determinar se o adalimumabe, em concentrações encontradas in vivo, pode ter um impacto direto na osteoclastogênese humana e na reabsorção óssea. Talvez mais importante, a correlação dos resultados dos osteoclastos com os parâmetros clínicos estudados pode nos permitir perceber se um eventual efeito nos osteoclastos pode se correlacionar com a resposta clínica à medicação, indicando um possível mecanismo de ação adicional do Adalimumabe na Artrite Reumatoide.