골흡수, 파골세포형성 및 아달리무맙 (BROCA)

파골 세포(OC)는 류마티스 관절염(RA)에서 뼈 및 관절 파괴에 참여하는 뼈 분해에 특화된 세포입니다. 실험 모델은 OC가 관절염의 국소 골 흡수에 필수적이라는 것을 분명히 보여주었습니다. RANKL 녹아웃 마우스(1; 2), OPG(3-6) 또는 c-fos(-/-) hTNF 트랜스제닉 마우스(7)를 투여받은 쥐(7)에서 관절염 유도는 염증을 일으키지만 뼈 침식은 일으키지 않습니다. 전신성 골다공증은 RA(8; 9)에서 중요한 동반이환입니다. OC 활성화로 인한 전신 뼈 재흡수의 증가는 초기(< 2년) RA에서도 발생하며 질병 활성도와 관련이 있습니다(10). 비스포스포네이트는 염증성 질환에서 전신 골 손실을 예방하는 데 효과적이지만 알 수 없는 이유로 관절 주위 골 침식 및 관절 파괴에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. 마지막으로, 파골세포 형성에 영향을 미치는 전신적 요인이 대조군과 비교할 때 중증 관절염 환자의 골수에서 증가된 OC 형성으로 나타난 바와 같이 RA에 존재하는 것으로 보입니다(11).

TNF-알파는 RA의 주요 병리학적 매개체입니다. 직접적으로 골 흡수를 유도하여 파골세포 생성을 자극하거나(12, 13) 간접적으로 골아세포에 의한 RANKL, OPG 및 프로스타글란딘 생산에 영향을 미침으로써(14, 15). 이러한 경로는 치주염, 류마티스 관절염 및 골다공증과 같은 여러 질병의 병태생리에 중요할 수 있습니다(16; 17). 생쥐에서 TNF-알파는 생체 내에서 파골세포 전구체의 수를 증가시키지만 그 역할은 더 복잡하고 파골세포 형성 억제 메커니즘과도 연관될 수 있습니다(18; 19). 사실, 특정 조건에서 TNF-알파는 파골 세포 생성을 감소시킬 수 있으므로(20), TNF 차단의 생체 내 효과는 이러한 모델에서 예측하기 어려울 수 있습니다.

항-TNF 제제는 RA에서 골 파괴를 감소시키지만 앞 단락에서 설명한 바와 같이 TNF가 파골세포 형성 및 활성에 길항 효과를 갖는 것으로 나타났기 때문에 이 효과가 어떻게 달성되는지는 명확하지 않습니다. 더욱이, 인간의 파골 세포 생물학에 대한 항-TNF 요법의 효과에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

작업 가설

이 프로젝트는 서로 다르지만 밀접하게 관련된 두 가지 가설을 기반으로 합니다.

1. 항TNF 제제(이 경우 아달리무맙)로 치료하면 순환하는 파골세포 전구체의 수, 시험관 내 파골세포 형성 및 시험관 내 골흡수를 감소시킬 수 있습니다.
2. 시험관 내에서 파골 세포를 구별하는 데 사용되는 배양 배지에 Adalimumab을 추가하면 파골 세포 생성 및 골 흡수를 억제할 수 있습니다.

목표

파골세포의 골 재흡수는 파골세포를 생성하는 능력(파골세포 형성)과 개별 파골세포 활동에 따라 달라집니다. 우리의 목표는 Adalimumab으로 RA 환자를 치료하기 전과 치료하는 동안 RA 환자의 말초 혈액 내 파골 세포 전구체 수, 시험관 내 파골 세포 생성 및 파골 세포 활동에 대한 항 TNF 요법의 효과를 연구하는 것입니다.

연구 계획

시험 설계: 항TNF 치료가 파골세포 형성 및 파골세포 활동에 미치는 영향을 연구하기 위한 임상 추적으로 우리는 치료 시작 전과 후 두 시점, 3개월 및 6개월에 류마티스관절염 환자의 한 코호트를 연구할 것입니다. 환자는 자신의 통제가 될 것입니다(연구 전/후). 치료 도입 후 두 시점이 필요한 이유는 다음 두 가지입니다. 1) 연구된 매개변수에 대한 최종 효과가 최고점에 도달할 수 있는 시간을 알 수 없으며 2) 측정된 매개변수가 시간이 지남에 따라 안정적임을 보장합니다.

결과:

1차 결과는 Adalimumab(3개월 및 6개월) 치료 전후에 다음 매개변수의 차이입니다.

1. 말초 혈액에 있는 파골 세포 전구체(CD14+) 세포의 수
2. 체외에서 생성된 파골 세포의 수
3. 체외 골 흡수량

이차 결과:

1. 파골세포 형성에서 시험관내 약물의 직접적인 효과를 검출하기 위해 치료된 환자의 혈장에서 발견되는 농도 범위의 외인성 아달리무맙의 존재 하에 병렬 시험관내 분화 검정(생성된 파골세포의 수 및 골 흡수량).
2. DAS28 점수(21; 22)로 정의된 질병 활동
3. M-HAQ에 의한 기능 상태의 변화(23)

환자 코호트:

포함 기준: RA(24)에 대한 ACR 기준을 충족하고 Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke의 류마티스 전문의로부터 Adalimumab 처방을 받은 환자. 다른 항-TNF 요법을 받은 환자는 이전 약물의 5 반감기 후에만 자격이 있습니다. 환자는 정보에 입각한 동의서에 기꺼이 서명해야 합니다. 항TNF 및 기타 생물학적 제제 이외의 병용 약물은 허용되며 치료하는 류마티스 전문의는 환자에게 최선의 이익을 위해 이를 조정할 수 있습니다. 따라서 이 연구는 환자의 일상적인 치료에 영향을 미치지 않습니다. 수반되는 약물은 기록되고 최종 분석에서 고려됩니다.

제외 기준: 18세 미만이거나 정보에 입각한 동의를 제공할 수 없거나 제공할 의향이 없는 환자, Adalimumab을 시작하는 환자는 이전 항-TNF 요법 중단 후 반감기가 5년 미만입니다.

샘플 크기 및 통계: 샘플 크기는 1차 결과의 분포 및 분산, 즉 시험관 내에서 생성된 파골 세포 수를 기반으로 계산되었습니다. 우리 연구실에 있는 51명의 정상 기증자 집단에서 생성된 파골 세포의 수는 웰당 601.1 ± 156.8 파골 세포였습니다(2007년 캐나다 류마티스 협회 연례 회의에서 발표된 데이터, Journal of Rheumatology에서 발표됨). 5%(α = 0.05)의 테스트 유의 수준과 그룹 간 최소 100개의 파골 세포/웰의 차이를 감지하기 위한 80%의 검정력(쌍을 이룬 양측 t-테스트)을 고려하여 총 22명의 환자. 기술적인 이유로 인한 10% 손실을 고려하여 샘플 크기는 25명의 환자로 설정되었습니다.

방법론

혈액 샘플: 아달리무맙 치료 시작 전 2개월 이내 및 약물 첫 투여 후 3개월 및 6개월(±2주)에 각 환자로부터 헤파린 내 혈액 50ml를 채취합니다. DAS-28, HAQ 점수, 동반이환 및 병용 약물은 동시에 결정 및 기록되며 코드화된 데이터는 보안 데이터베이스에 저장됩니다.

파골 세포 연구:

파골 세포 형성: PBMC는 Ficoll-Hypaque 구배에 의해 혈액 50ml에서 분리되고 CD14+ OC 전구체의 수는 FACS에 의해 결정됩니다. PBMC의 전체 집단을 뼈 조각 또는 유리 슬라이드가 포함된 48-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 세포를 재조합 RANKL(75ng/ml) 및 M-유전자의 존재 하에 21일 동안 분화하도록 허용할 것입니다. CSF(10ng/ml). 그런 다음 세포를 고정하고 TRAP 활성과 헤마톡실린으로 염색합니다. 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP+ 세포의 수는 각 웰에서 계산됩니다. Triplicates는 각 환자에 대해 사용됩니다. 병렬 웰에서 세포는 동일한 조건에서 배양되지만 처리 후 생체 내에서 발견되는 것과 비슷한 농도의 Adalimumab이 존재합니다.

OC 흡수 활성: 골흡수 분석의 경우, 뼈 조각에서 21일 동안 분화된 세포를 TRAP 및 0.2% 톨루이딘 블루로 염색합니다. 흡수 표면적은 이미지 분석 프로그램인 Simple PCI를 사용하여 정량화됩니다. 병렬 분석은 Adalimumab의 존재 하에 수행됩니다.

통계 분석:

개입 전후의 그룹은 정규 분포 변수에 대한 매개 변수 쌍 양측 테스트와 적절한 경우 비모수 테스트를 사용하여 비교됩니다.

예상 결과

이러한 연구를 통해 Adalimumab 치료가 순환하는 파골 세포 전구체의 수, 파골 세포 생성 및 이들 세포의 골 흡수 활성에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다. 또한 생체 내에서 발견되는 농도의 Adalimumab이 인간 파골 세포 형성 및 골 흡수에 직접적인 영향을 미칠 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다. 아마도 더 중요한 것은 파골세포 결과와 연구된 임상 매개변수의 상관관계가 파골세포에 대한 최종 효과가 약물에 대한 임상 반응과 상관관계가 있는지 여부에 대한 통찰력을 제공하여 류마티스 관절염에서 Adalimumab의 가능한 추가 작용 메커니즘을 나타냅니다.