Resorción ósea, osteoclastogénesis y adalimumab (BROCA)

Los osteoclastos (OCs) son células especializadas en la degradación ósea que participan en la destrucción ósea y articular en la Artritis Reumatoide (AR). Los modelos experimentales han demostrado claramente que los AO son esenciales para la reabsorción ósea local en la artritis. En ratones knockout para RANKL (1; 2), en ratas que reciben OPG (3-6) o en ratones transgénicos c-fos (-/-) hTNF (7), la inducción de artritis conduce a inflamación pero no a erosión ósea. La osteoporosis sistémica es una comorbilidad importante en la AR(8; 9). El aumento de la resorción ósea sistémica debido a la activación de OC ocurre incluso en la AR temprana (< 2 años) y se correlaciona con la actividad de la enfermedad (10). Los bisfosfonatos son efectivos para prevenir la pérdida ósea sistémica en enfermedades inflamatorias, pero por razones desconocidas no parecen influir en la erosión ósea periarticular ni en la destrucción articular. Finalmente, un factor sistémico que afecta la osteoclastogénesis parece estar presente en la AR, como lo demuestra una mayor formación de OC a partir de la médula ósea de pacientes con artritis severa en comparación con los controles(11).

El TNF-alfa es un importante mediador patológico en la AR. Puede inducir la resorción ósea directamente, estimulando la osteoclastogénesis(12; 13) o indirectamente, al influir en la producción de RANKL, OPG y prostaglandinas por parte de los osteoblastos(14; 15). Estas vías pueden ser importantes para la fisiopatología de varias enfermedades como la periodontitis, la artritis reumatoide y la osteoporosis(16; 17). En ratones, el TNF-alfa aumenta el número de precursores de osteoclastos in vivo pero, sin embargo, su función puede ser más compleja e implicar también mecanismos inhibidores de la osteoclastogénesis(18; 19); de hecho, en ciertas condiciones, el TNF-alfa puede disminuir la osteoclastogénesis(20), por lo que el efecto in vivo del bloqueo del TNF puede ser difícil de predecir a partir de estos modelos.

Los agentes anti-TNF reducen la destrucción ósea en la AR pero no está claro cómo se logra este efecto ya que, como se describe en el párrafo anterior, se ha demostrado que el TNF tiene efectos antagónicos en la formación y actividad de los osteoclastos. Además, se sabe poco sobre el efecto de la terapia anti-TNF en la biología de los osteoclastos en humanos.

Hipótesis de trabajo

Este proyecto se basa en dos hipótesis diferentes pero estrechamente relacionadas:

1. El tratamiento con agentes anti-TNF (Adalimumab en este caso) puede reducir el número de precursores de osteoclastos circulantes, la osteoclastogénesis in vitro y la resorción ósea in vitro.
2. La adición de Adalimumab al medio de cultivo utilizado para diferenciar osteoclastos in vitro puede inhibir la osteoclastogénesis y la resorción ósea.

Objetivos

La resorción ósea osteoclástica depende tanto de la capacidad de generar osteoclastos (osteoclastogénesis) como de la actividad osteoclástica individual. Nuestro objetivo es estudiar el efecto de la terapia anti-TNF sobre el número de precursores de osteoclastos en sangre periférica de pacientes con AR, sobre la osteoclastogénesis in vitro y sobre la actividad osteoclástica antes y durante el tratamiento de pacientes con AR con Adalimumab.

Plan de investigación

Diseño del ensayo: Como un ensayo clínico dirigido a estudiar el impacto del tratamiento anti-TNF en la osteoclastogénesis y la actividad de los osteoclastos, estudiaremos una cohorte de pacientes con AR antes y en dos momentos después del inicio de la terapia, 3 y 6 meses, para que cada el paciente será su propio control (antes/después del estudio). Los dos puntos de tiempo después de la introducción de la terapia son necesarios por dos razones: 1) Se desconoce el momento en que un efecto eventual sobre los parámetros estudiados puede alcanzar su punto máximo y 2) Para asegurar que los parámetros medidos sean estables en el tiempo.

Resultados:

Los resultados primarios serán la diferencia en los siguientes parámetros antes y después del tratamiento con Adalimumab (3 y 6 meses):

1. el número de células precursoras de osteoclastos (CD14+) en la sangre periférica
2. el número de osteoclastos generados in vitro
3. la cantidad de reabsorción ósea in vitro

Resultados secundarios:

1. Ensayos paralelos de diferenciación in vitro (número de osteoclastos generados y cantidad de reabsorción ósea) en presencia de Adalimumab exógeno en el rango de concentración encontrado en el plasma de los pacientes tratados para detectar un efecto directo de la medicación in vitro en la osteoclastogénesis.
2. actividad de la enfermedad definida como una puntuación DAS28 (21; 22)
3. Cambio de estado funcional por el M-HAQ (23)

Cohorte de pacientes:

Criterios de inclusión: Pacientes que cumplieran los Criterios ACR para AR(24) y que hayan recibido prescripción de Adalimumab por parte de un reumatólogo del Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Los pacientes que han recibido otras terapias anti-TNF son elegibles solo después de 5 vidas medias de la medicación anterior. Los pacientes deben estar dispuestos a firmar un consentimiento informado. Se permite la medicación concomitante distinta de los anti-TNF y otros productos biológicos y el reumatólogo tratante puede ajustarla según el mejor interés de los pacientes. Este estudio, por lo tanto, no tiene impacto en el tratamiento de rutina de los pacientes. La medicación concomitante será registrada y considerada en el análisis final.

Criterios de exclusión: Pacientes menores de 18 años o que no puedan o no quieran dar su consentimiento informado, pacientes que comiencen Adalimumab con menos de cinco vidas medias después de la interrupción de una terapia anti-TNF anterior.

Tamaño de la muestra y estadísticas: el tamaño de la muestra se calculó en función de la distribución y la varianza del resultado primario, es decir, la cantidad de osteoclastos generados in vitro. A partir de una población de 51 donantes normales en nuestro laboratorio, el número de osteoclastos generados fue de 601,1 ± 156,8 osteoclastos/pozo (datos presentados en la reunión anual de 2007 de la Asociación Canadiense de Reumatología, en prensa en el Journal of Rheumatology). Consideramos un nivel de significación de la prueba del 5 % (α = 0,05) y una potencia del 80 % para detectar una diferencia de al menos 100 osteoclastos/pozo entre los grupos (prueba t de dos colas pareada), lo que llevó a un total de 22 pacientes. Considerando una pérdida del 10% por razones técnicas, el tamaño de la muestra se estableció en 25 pacientes.

Metodología

Muestras de sangre: Se recogerán 50 ml de sangre en heparina de cada paciente no más de 2 meses antes del inicio del tratamiento con Adalimumab y 3 y 6 meses después de la primera administración del fármaco (± 2 semanas). Los puntajes DAS-28, HAQ, las comorbilidades y la medicación concomitante se determinarán y registrarán al mismo tiempo y los datos codificados se almacenarán en una base de datos segura.

Estudios de osteoclastos:

Osteoclastogénesis: las PBMC se aislarán de 50 ml de sangre mediante un gradiente de Ficoll-Hypaque y el número de precursores de OC CD14+ se determinará mediante FACS. Toda la población de PBMC se sembrará en placas de cultivo tisular de 48 pocillos que contengan un trozo de hueso o un portaobjetos de vidrio, y se permitirá que las células se diferencien durante 21 días en presencia de RANKL recombinante (75 ng/ml) y M- LCR (10 ng/ml). A continuación, las células se fijan y se tiñen para actividad TRAP y con hematoxilina. Se contará en cada pocillo el número de células TRAP+ que contengan tres o más núcleos. Se utilizarán triplicados para cada paciente. En pocillos paralelos se incubarán las células en las mismas condiciones pero en presencia de Adalimumab en concentración comparable a la encontrada in vivo tras el tratamiento.

Actividad de reabsorción de OC: para los ensayos de resorción ósea, las células diferenciadas durante 21 días en cortes de hueso se tiñerán para TRAP y azul de toluidina al 0,2 %. El área de superficie de reabsorción se cuantificará utilizando el programa de análisis de imágenes, Simple PCI. Se realizarán ensayos paralelos en presencia de Adalimumab.

Análisis estadístico:

Los grupos antes y después de la intervención se compararán mediante pruebas paramétricas de dos colas pareadas para las variables con distribución normal y con pruebas no paramétricas cuando corresponda.

Resultados esperados

Estos estudios nos permitirán determinar si el tratamiento con Adalimumab tiene efecto sobre el número de precursores de osteoclastos circulantes, sobre la generación de osteoclastos y sobre la actividad de reabsorción ósea de estas células. También permitirá determinar si Adalimumab, en las concentraciones encontradas in vivo, puede tener un impacto directo en la osteoclastogénesis humana y la resorción ósea. Quizás lo que es más importante, la correlación de los resultados de los osteoclastos con los parámetros clínicos estudiados puede permitirnos comprender si un efecto eventual sobre los osteoclastos puede correlacionarse con la respuesta clínica al medicamento, lo que indica un posible mecanismo de acción adicional de Adalimumab en la artritis reumatoide.