Knochenresorption, Osteoklastogenese und Adalimumab (BROCA)

Osteoklasten (OCs) sind auf den Knochenabbau spezialisierte Zellen, die an der Knochen- und Gelenkzerstörung bei rheumatoider Arthritis (RA) beteiligt sind. Experimentelle Modelle haben eindeutig gezeigt, dass OCs für die lokale Knochenresorption bei Arthritis essentiell sind. Bei RANKL-Knockout-Mäusen(1; 2), bei Ratten, die OPG(3-6) erhielten, oder bei c-fos(-/-)-hTNF-transgenen Mäusen(7) führt die Induktion von Arthritis zu Entzündungen, aber nicht zu Knochenerosion. Systemische Osteoporose ist eine wichtige Komorbidität bei RA(8; 9). Eine erhöhte systemische Knochenresorption aufgrund der OC-Aktivierung tritt bereits bei früher RA (< 2 Jahre) auf und korreliert mit der Krankheitsaktivität (10). Bisphosphonate verhindern wirksam systemischen Knochenschwund bei entzündlichen Erkrankungen, scheinen jedoch aus unbekannten Gründen keinen Einfluss auf periartikuläre Knochenerosion und Gelenkzerstörung zu haben. Schließlich scheint bei RA ein systemischer Faktor vorhanden zu sein, der die Osteoklastogenese beeinflusst, wie die erhöhte Bildung von OCs aus dem Knochenmark bei Patienten mit schwerer Arthritis im Vergleich zu Kontrollpersonen zeigt (11).

TNF-alpha ist ein wichtiger pathologischer Mediator bei RA. Es kann die Knochenresorption entweder direkt induzieren und so die Osteoklastogenese stimulieren (12; 13) oder indirekt durch Beeinflussung der RANKL-, OPG- und Prostaglandinproduktion durch Osteoblasten (14; 15). Diese Signalwege können für die Pathophysiologie verschiedener Krankheiten wie Parodontitis, rheumatoider Arthritis und Osteoporose wichtig sein (16; 17). Bei Mäusen erhöht TNF-alpha die Anzahl der Osteoklastenvorläufer in vivo, seine Rolle könnte jedoch komplexer sein und auch Mechanismen zur Hemmung der Osteoklastogenese beinhalten (18; 19); Tatsächlich kann TNF-alpha unter bestimmten Bedingungen die Osteoklastogenese verringern (20), sodass die In-vivo-Wirkung der TNF-Blockierung anhand dieser Modelle möglicherweise schwer vorherzusagen ist.

Anti-TNF-Mittel reduzieren die Knochenzerstörung bei RA, es ist jedoch nicht klar, wie dieser Effekt erreicht wird, da TNF, wie im vorherigen Absatz beschrieben, nachweislich antagonistische Wirkungen auf die Bildung und Aktivität von Osteoklasten hat. Darüber hinaus ist wenig über die Wirkung einer Anti-TNF-Therapie auf die Osteoklastenbiologie beim Menschen bekannt.

Arbeitshypothese

Dieses Projekt basiert auf zwei unterschiedlichen, aber eng miteinander verbundenen Hypothesen:

1. Die Behandlung mit Anti-TNF-Wirkstoffen (in diesem Fall Adalimumab) kann die Anzahl zirkulierender Osteoklastenvorläufer, die In-vitro-Osteoklastogenese und die In-vitro-Knochenresorption verringern.
2. Die Zugabe von Adalimumab zum Kulturmedium, das zur Differenzierung von Osteoklasten in vitro verwendet wird, kann die Osteoklastogenese und die Knochenresorption hemmen.

Ziele

Die osteoklastische Knochenresorption hängt sowohl von der Fähigkeit zur Bildung von Osteoklasten (Osteoklastogenese) als auch von der individuellen Osteoklastenaktivität ab. Unser Ziel ist es, die Wirkung einer Anti-TNF-Therapie auf die Anzahl der Osteoklastenvorläufer im peripheren Blut von Patienten mit RA, auf die In-vitro-Osteoklastogenese und auf die Osteoklastenaktivität vor und während der Behandlung von Patienten mit RA mit Adalimumab zu untersuchen.

Forschungsplan

Studiendesign: Als klinischer Versuch, der darauf abzielt, die Auswirkungen der Anti-TNF-Behandlung auf Osteoklastogenese und Osteoklastenaktivität zu untersuchen, werden wir eine Kohorte von Patienten mit RA vor und zu zwei Zeitpunkten nach Beginn der Therapie, 3 und 6 Monate, untersuchen, sodass jeweils Der Patient ist seine/ihre eigene Kontrolle (vor/nach der Studie). Die zwei Zeitpunkte nach Einführung der Therapie sind aus zwei Gründen erforderlich: 1) Der Zeitpunkt, zu dem eine eventuelle Wirkung auf die untersuchten Parameter ihren Höhepunkt erreichen kann, ist nicht bekannt und 2) Um sicherzustellen, dass die gemessenen Parameter über die Zeit stabil sind.

Ergebnisse:

Primäre Ergebnisse werden der Unterschied in den folgenden Parametern vor und nach der Behandlung mit Adalimumab (3 und 6 Monate) sein:

1. die Anzahl der Osteoklasten-Vorläuferzellen (CD14+) im peripheren Blut
2. die Anzahl der in vitro erzeugten Osteoklasten
3. das Ausmaß der Knochenresorption in vitro

Sekundäre Ergebnisse:

1. Parallele In-vitro-Differenzierungstests (Anzahl der erzeugten Osteoklasten und Ausmaß der Knochenresorption) in Gegenwart von exogenem Adalimumab in dem im Plasma behandelter Patienten gefundenen Konzentrationsbereich, um eine direkte Wirkung des Medikaments in vitro auf die Osteoklastogenese nachzuweisen.
2. Krankheitsaktivität definiert als DAS28-Score (21; 22)
3. Änderung des Funktionsstatus durch das M-HAQ (23)

Patientenkohorte:

Einschlusskriterien: Patienten, die die ACR-Kriterien für RA(24) erfüllen und von einem Rheumatologen am Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke ein Adalimumab-Rezept erhalten haben. Patienten, die andere Anti-TNF-Therapien erhalten haben, sind erst nach Ablauf von 5 Halbwertszeiten der vorherigen Medikation teilnahmeberechtigt. Patienten müssen bereit sein, eine Einverständniserklärung zu unterzeichnen. Die gleichzeitige Einnahme anderer Medikamente als Anti-TNFs und anderer Biologika ist zulässig und kann vom behandelnden Rheumatologen im besten Interesse des Patienten angepasst werden. Diese Studie hat daher keinen Einfluss auf die routinemäßige Behandlung der Patienten. Begleitmedikation wird erfasst und abschließend berücksichtigt.

Ausschlusskriterien: Patienten unter 18 Jahren oder nicht in der Lage oder willens, eine Einverständniserklärung abzugeben, Patienten, die weniger als fünf Halbwertszeiten nach der Unterbrechung einer vorherigen Anti-TNF-Therapie mit Adalimumab beginnen.

Probengröße und Statistik: Die Probengröße wurde basierend auf der Verteilung und Varianz des primären Ergebnisses berechnet, d. h. der Anzahl der in vitro erzeugten Osteoklasten. Aus einer Population von 51 normalen Spendern in unserem Labor betrug die Anzahl der erzeugten Osteoklasten 601,1 ± 156,8 Osteoklasten/Well (Daten präsentiert auf der Jahrestagung 2007 der Canadian Rheumatology Association, im Druck im Journal of Rheumatology). Wir haben ein Testsignifikanzniveau von 5 % (α = 0,05) und eine Trennschärfe von 80 % berücksichtigt, um einen Unterschied von mindestens 100 Osteoklasten/Well zwischen den Gruppen zu erkennen (gepaarter zweiseitiger t-Test), was zu einer Gesamtsumme von führte 22 Patienten. Unter Berücksichtigung eines technisch bedingten Verlusts von 10 % wurde die Stichprobengröße auf 25 Patienten festgelegt.

Methodik

Blutproben: 50 ml Blut in Heparin werden von jedem Patienten spätestens 2 Monate vor Beginn der Behandlung mit Adalimumab und 3 und 6 Monate nach der ersten Verabreichung des Arzneimittels (± 2 Wochen) entnommen. DAS-28, HAQ-Scores, Komorbiditäten und Begleitmedikation werden gleichzeitig bestimmt und aufgezeichnet und die codierten Daten in einer sicheren Datenbank gespeichert.

Osteoklastenstudien:

Osteoklastogenese: PBMCs werden aus 50 ml Blut durch einen Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert und die Anzahl der CD14+ OC-Vorläufer wird durch FACS bestimmt. Die gesamte PBMC-Population wird in 48-Well-Gewebekulturplatten mit einem Knochenstück oder einem Objektträger ausplattiert, und die Zellen werden 21 Tage lang in Gegenwart von rekombinantem RANKL (75 ng/ml) und M- differenziert. CSF (10 ng/ml). Anschließend werden die Zellen fixiert und auf TRAP-Aktivität sowie mit Hämatoxylin gefärbt. In jeder Vertiefung wird die Anzahl der TRAP+-Zellen gezählt, die drei oder mehr Kerne enthalten. Für jeden Patienten werden dreifache Exemplare verwendet. In parallelen Vertiefungen werden die Zellen unter den gleichen Bedingungen inkubiert, jedoch in Gegenwart von Adalimumab in einer Konzentration, die mit der in vivo nach der Behandlung vergleichbaren Konzentration vergleichbar ist.

OC-Resorptionsaktivität: Für Knochenresorptionstests werden Zellen, die 21 Tage lang auf Knochenschnitten differenziert wurden, auf TRAP und 0,2 % Toluidinblau gefärbt. Die Resorptionsoberfläche wird mithilfe des Bildanalyseprogramms Simple PCI quantifiziert. Parallele Tests werden in Gegenwart von Adalimumab durchgeführt.

Statistische Analyse:

Die Gruppen vor und nach der Intervention werden unter Verwendung parametrischer gepaarter zweiseitiger Tests für die Variablen mit einer Normalverteilung und gegebenenfalls mit nichtparametrischen Tests verglichen.

Erwartete Ergebnisse

Mithilfe dieser Studien können wir feststellen, ob die Behandlung mit Adalimumab einen Einfluss auf die Anzahl zirkulierender Osteoklastenvorläufer, auf die Bildung von Osteoklasten und auf die knochenresorbierende Aktivität dieser Zellen hat. Es wird auch ermöglichen zu bestimmen, ob Adalimumab in in vivo gefundenen Konzentrationen einen direkten Einfluss auf die Osteoklastogenese und Knochenresorption beim Menschen haben kann. Vielleicht noch wichtiger: Die Korrelation der Osteoklastenergebnisse mit den untersuchten klinischen Parametern kann uns Aufschluss darüber geben, ob eine eventuelle Wirkung auf Osteoklasten mit der klinischen Reaktion auf das Medikament korreliert, was auf einen möglichen zusätzlichen Wirkmechanismus von Adalimumab bei rheumatoider Arthritis hinweist.