Csontfelszívódás, oszteoklasztogenezis és adalimumab (BROCA)

Az oszteoklasztok (OC-k) a csontlebontásra specializálódott sejtek, amelyek részt vesznek a rheumatoid arthritis (RA) csont- és ízületi pusztulásában. Kísérleti modellek egyértelműen bebizonyították, hogy az OC-k elengedhetetlenek a helyi csontfelszívódáshoz ízületi gyulladásban. RANKL knockout egerekben (1; 2), OPG(3-6)-t kapó patkányokban vagy c-fos(-/-) hTNF transzgenikus egerekben (7) az ízületi gyulladás indukciója gyulladáshoz vezet, de nem csonterózióhoz. A szisztémás osteoporosis fontos társbetegség az RA-ban (8; 9). Az OC aktiváció következtében megnövekedett szisztémás csontreszorpció már a korai (< 2 éves) RA-ban is előfordul, és korrelál a betegség aktivitásával (10). A biszfoszfonátok hatékonyak a szisztémás csontvesztés megelőzésében gyulladásos betegségekben, de ismeretlen okokból úgy tűnik, hogy nem befolyásolják a periartikuláris csonteróziót és az ízületek pusztítását. Végül úgy tűnik, hogy az osteoclastogenezist befolyásoló szisztémás faktor jelen van az RA-ban, amint azt a súlyos ízületi gyulladásban szenvedő betegek csontvelői OC-k fokozottabb képződése mutatja a kontrollokhoz képest (11).

A TNF-alfa az RA fő patológiás mediátora. Indukálhatja a csontreszorpciót vagy közvetlenül, serkentve az oszteoklasztogenezist (12; 13), vagy közvetetten, az oszteoblasztok RANKL-, OPG- és prosztaglandin-termelésének befolyásolásával (14; 15). Ezek az utak fontosak lehetnek számos betegség, például a parodontitis, a rheumatoid arthritis és az osteoporosis patofiziológiájában (16; 17). Egerekben a TNF-alfa növeli az oszteoklaszt prekurzorok számát in vivo, de szerepe összetettebb lehet, és az oszteoklasztogenezist gátló mechanizmusokat is magában foglalhatja (18; 19); Valójában bizonyos körülmények között a TNF-alfa csökkentheti az oszteoklasztogenezist (20), így a TNF-blokkoló in vivo hatását nehéz lehet megjósolni ezekből a modellekből.

Az anti-TNF szerek csökkentik a csontpusztulást RA-ban, de nem világos, hogyan érhető el ez a hatás, mivel az előző bekezdésben leírtak szerint a TNF-ről kimutatták, hogy antagonista hatást fejt ki az oszteoklasztok képződésében és aktivitásában. Ezenkívül keveset tudunk az anti-TNF-terápia emberi oszteoklasztbiológiára gyakorolt ​​hatásáról.

Munkahipotézis

Ez a projekt két különböző, de egymással szorosan összefüggő hipotézisen alapul:

1. Az anti-TNF szerekkel (ebben az esetben adalimumabbal) végzett kezelés csökkentheti a keringő oszteoklaszt prekurzorok számát, az in vitro osteoclastogenezist és az in vitro csontreszorpciót.
2. Az adalimumab hozzáadása az oszteoklasztok in vitro megkülönböztetésére használt táptalajhoz gátolhatja az oszteoklasztogenezist és a csontreszorpciót.

Célok

Az oszteoklasztos csontreszorpció mind az oszteoklasztképző képességtől (oszteoklasztogenezis), mind az egyéni osteoclast aktivitástól függ. Célunk az anti-TNF terápia hatásának tanulmányozása az RA-ban szenvedő betegek perifériás vérében az osteoclast prekurzorok számára, az in vitro osteoclastogenezisre és az osteoclast aktivitásra az RA-ban szenvedő betegek Adalimumab-kezelése előtt és alatt.

Kutatási terv

Kísérlettervezés: A TNF-ellenes kezelésnek az oszteoklasztogenezisre és az oszteoklasztok aktivitására gyakorolt ​​hatásának tanulmányozására szolgáló klinikai nyomvonalként RA-ban szenvedő betegek egy csoportját vizsgáljuk meg a terápia megkezdése előtt és utána két ponton, 3 és 6 hónappal úgy, hogy mindegyik a beteg a saját kontrollja lesz (a vizsgálat előtt/után). A terápia bevezetése utáni két időpontra két okból van szükség: 1) Nem ismert az az idő, amikor a vizsgált paraméterekre gyakorolt ​​végső hatás elérheti a csúcspontját, és 2) annak biztosítása, hogy a mért paraméterek időben stabilak legyenek.

Eredmények:

Az elsődleges eredmény a következő paraméterek különbsége lesz az adalimumab-kezelés előtt és után (3 és 6 hónap):

1. az oszteoklaszt prekurzor (CD14+) sejtek száma a perifériás vérben
2. az in vitro képződött oszteoklasztok száma
3. a csontreszorpció mennyisége in vitro

Másodlagos eredmények:

1. Párhuzamos in vitro differenciálódási vizsgálatok (a keletkezett oszteoklasztok száma és a csontreszorpció mennyisége) exogén adalimumab jelenlétében a kezelt betegek plazmájában található koncentráció-tartományban a gyógyszer in vitro közvetlen hatásának kimutatására az oszteoklasztogenezisben.
2. betegségaktivitás DAS28 pontszámként definiálva (21; 22)
3. A funkcionális állapot megváltozása az M-HAQ által (23)

Beteg kohorsz:

Bevételi kritériumok: Azok a betegek, akik megfelelnek az RA-ra vonatkozó ACR-kritériumoknak(24), és akik a Sherbrooke-i Center Hospitalier universitaire de Sherbrooke reumatológusától adalimumabot írt fel. Azok a betegek, akik más anti-TNF kezelésben részesültek, csak az előző gyógyszeres kezelés 5 felezési ideje után vehetők igénybe. A betegeknek hajlandónak kell lenniük egy tájékozott beleegyező nyilatkozat aláírására. Az anti-TNF-ektől és más biológiai szerektől eltérő egyidejű gyógyszeres kezelés megengedett, és ezt a kezelő reumatológus a betegek legjobb érdeke szerint módosíthatja. Ennek a vizsgálatnak tehát nincs hatása a betegek rutinkezelésére. Az egyidejűleg alkalmazott gyógyszeres kezelést rögzítik és figyelembe veszik a végső elemzésben.

Kizárási kritériumok: 18 éven aluli, vagy tájékozott beleegyezés megadására nem képes vagy nem hajlandó betegek, olyan betegek, akik az adalimumab-kezelést 5-nél kevesebb felezési idejüknél kezdik meg egy korábbi anti-TNF-terápia megszakítása után.

Mintanagyság és statisztika: A mintanagyságot az elsődleges kimenetel eloszlása ​​és varianciája, azaz az in vitro generált oszteoklasztok száma alapján számítottuk ki. A laboratóriumunkban lévő 51 normál donorból álló populációból a keletkezett oszteoklasztok száma 601,1 ± 156,8 oszteoklaszt/üreg volt (az adatok a Kanadai Rheumatológiai Szövetség 2007-es éves ülésén jelentek meg, a Journal of Rheumatology folyóiratban). 5%-os teszt szignifikancia szintet (α = 0,05) és 80%-os teljesítményt vettünk figyelembe legalább 100 oszteoklaszt/lyuk különbség kimutatására a csoportok között (páros kétfarkú t-teszt), ami összesen 22 beteg. A technikai okok miatti 10%-os veszteséget figyelembe véve a minta nagyságát 25 betegben állapították meg.

Módszertan

Vérminták: 50 ml heparinos vért kell gyűjteni minden betegtől legfeljebb 2 hónappal az Adalimumab-kezelés megkezdése előtt, valamint 3 és 6 hónappal a gyógyszer első beadása után (± 2 hét). A DAS-28, a HAQ-pontszámok, a társbetegségek és az egyidejű gyógyszeres kezelés meghatározása és rögzítése egyidejűleg történik, és a kódolt adatok biztonságos adatbázisban tárolódnak.

Osteoclast vizsgálatok:

Osteoklasztogenezis: A PBMC-ket 50 ml vérből Ficoll-Hypaque gradienssel izoláljuk, és a CD14+ OC prekurzorok számát a FACS határozza meg. A PBMC-k teljes populációját 48 lyukú szövettenyésztő lemezekre helyezzük, amelyek csontszeletet vagy üveglemezt tartalmaznak, és a sejteket 21 napig hagyjuk differenciálódni rekombináns RANKL (75 ng/ml) és M- jelenlétében. CSF (10 ng/ml). A sejteket ezután fixáljuk és TRAP aktivitásra és hematoxilinnel megfestjük. A három vagy több sejtmagot tartalmazó TRAP+ sejtek számát minden egyes lyukban megszámoljuk. Minden betegnél három példányt alkalmazunk. Párhuzamos lyukakban a sejteket azonos körülmények között inkubáljuk, de adalimumab jelenlétében a kezelés után in vivo találthoz hasonló koncentrációban.

OC reszorpciós aktivitás: A csontreszorpciós vizsgálatokhoz a csontszeleteken 21 napig differenciált sejteket TRAP-re és 0,2%-os toluidin kékre festik. A reszorpciós felület számszerűsítése a Simple PCI képelemző programmal történik. A parellel vizsgálatokat adalimumab jelenlétében kell elvégezni.

Statisztikai analízis:

A beavatkozás előtti és utáni csoportokat a normál eloszlású változók paraméteres páros, kétvégű tesztjeivel, valamint adott esetben nem parametrikus tesztekkel kell összehasonlítani.

Várható eredmények

Ezek a vizsgálatok lehetővé teszik annak meghatározását, hogy az Adalimumab-kezelés hatással van-e a keringő oszteoklaszt prekurzorok számára, az oszteoklasztok képződésére és e sejtek csontreszorpciós aktivitására. Lehetővé teszi továbbá annak meghatározását, hogy az adalimumab az in vivo talált koncentrációkban közvetlen hatással lehet-e az emberi oszteoklasztogenezisre és a csontreszorpcióra. Talán még fontosabb, hogy az oszteoklaszt-eredmények és a vizsgált klinikai paraméterek korrelációja lehetővé teszi számunkra, hogy betekintést nyerjünk abba, hogy az osteoclastokra gyakorolt ​​esetleges hatás összefüggésben állhat-e a gyógyszerre adott klinikai válasszal, jelezve az Adalimumab lehetséges további hatásmechanizmusát rheumatoid arthritisben.