Resorpcja kości, osteoklastogeneza i adalimumab (BROCA)

Osteoklasty (OC) to komórki wyspecjalizowane w degradacji kości, które uczestniczą w niszczeniu kości i stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS). Modele eksperymentalne wyraźnie wykazały, że OC są niezbędne do miejscowej resorpcji kości w zapaleniu stawów. U myszy z nokautem RANKL (1; 2), u szczurów otrzymujących OPG (3-6) lub u myszy transgenicznych c-fos (-/-) hTNF (7) indukcja zapalenia stawów prowadzi do stanu zapalnego, ale nie do erozji kości. Osteoporoza układowa jest ważną chorobą współistniejącą w RZS(8; 9). Zwiększona układowa resorpcja kości na skutek aktywacji OC występuje już we wczesnym (<2 lat) RZS i koreluje z aktywnością choroby(10). Bisfosfoniany są skuteczne w zapobieganiu ogólnoustrojowej utracie masy kostnej w chorobach zapalnych, ale z nieznanych przyczyn nie wydają się wpływać na erozję kości okołostawowej i destrukcję stawów. Wreszcie wydaje się, że w RZS występuje ogólnoustrojowy czynnik wpływający na osteoklastogenezę, na co wskazuje zwiększone tworzenie OC ze szpiku kostnego pacjentów z ciężkim zapaleniem stawów w porównaniu z grupą kontrolną(11).

TNF-alfa jest głównym mediatorem patologicznym w RZS. Może indukować resorpcję kości bezpośrednio, stymulując osteoklastogenezę(12; 13) lub pośrednio, wpływając na produkcję RANKL, OPG i prostaglandyn przez osteoblasty(14; 15). Szlaki te mogą mieć znaczenie dla patofizjologii kilku chorób, takich jak zapalenie przyzębia, reumatoidalne zapalenie stawów i osteoporoza(16; 17). U myszy TNF-alfa zwiększa liczbę prekursorów osteoklastów in vivo, ale jego rola może być jednak bardziej złożona i implikować również mechanizmy hamujące osteoklastogenezę(18; 19); w rzeczywistości w pewnych warunkach TNF-alfa może zmniejszać osteoklastogenezę(20), więc efekt blokowania TNF in vivo może być trudny do przewidzenia na podstawie tych modeli.

Środki anty-TNF zmniejszają niszczenie kości w RZS, ale nie jest jasne, jak osiąga się ten efekt, ponieważ, jak opisano w poprzednim akapicie, wykazano, że TNF ma działanie antagonistyczne w tworzeniu i aktywności osteoklastów. Ponadto niewiele wiadomo na temat wpływu terapii anty-TNF na biologię osteoklastów u ludzi.

Hipoteza robocza

Projekt ten opiera się na dwóch różnych, ale ściśle powiązanych hipotezach:

1. Leczenie lekami anty-TNF (w tym przypadku adalimumabem) może zmniejszać liczbę krążących prekursorów osteoklastów, osteoklastogenezę in vitro i resorpcję kości in vitro.
2. Dodanie adalimumabu do pożywki stosowanej do różnicowania osteoklastów in vitro może hamować osteoklastogenezę i resorpcję kości.

Cele

Resorpcja kości przez osteoklasty zależy zarówno od zdolności do generowania osteoklastów (osteoklastogeneza), jak i od indywidualnej aktywności osteoklastów. Naszym celem jest zbadanie wpływu terapii anty-TNF na liczbę prekursorów osteoklastów we krwi obwodowej pacjentów z RZS, na osteoklastogenezę in vitro oraz na aktywność osteoklastów przed iw trakcie leczenia adalimumabem pacjentów z RZS.

Plan badań

Projekt badania: W ramach ścieżki klinicznej mającej na celu zbadanie wpływu leczenia anty-TNF na osteoklastogenezę i aktywność osteoklastów będziemy badać jedną kohortę pacjentów z RZS przed i w dwóch punktach po rozpoczęciu terapii, 3 i 6 miesięcy, tak aby każda pacjent będzie swoją własną kontrolą (przed/po badaniu). Dwa punkty czasowe po wprowadzeniu terapii są potrzebne z dwóch powodów: 1) Czas, w którym ostateczny wpływ na badane parametry może osiągnąć swój szczyt, nie jest znany oraz 2) Aby zapewnić stabilność mierzonych parametrów w czasie.

Wyniki:

Głównymi wynikami będą różnice w następujących parametrach przed i po leczeniu adalimumabem (3 i 6 miesięcy):

1. liczba komórek prekursorowych osteoklastów (CD14+) we krwi obwodowej
2. liczba osteoklastów generowanych in vitro
3. stopień resorpcji kości in vitro

Wyniki drugorzędne:

1. Równoległe testy różnicowania in vitro (liczba generowanych osteoklastów i stopień resorpcji kości) w obecności egzogennego adalimumabu w zakresie stężeń występujących w osoczu leczonych pacjentów w celu wykrycia bezpośredniego wpływu leku in vitro na osteoklastogenezę.
2. aktywność choroby zdefiniowana jako wynik DAS28 (21; 22)
3. Zmiana statusu funkcjonalnego przez M-HAQ (23)

Kohorta pacjentów:

Kryteria włączenia: Pacjenci spełniający kryteria ACR dla RZS(24) i którzy otrzymali receptę na adalimumab od reumatologa z Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Pacjenci, którzy otrzymywali inne terapie anty-TNF, kwalifikują się dopiero po 5 okresach półtrwania poprzedniego leku. Pacjenci muszą być gotowi do podpisania świadomej zgody. Jednoczesne stosowanie leków innych niż anty-TNF i inne leki biologiczne jest dozwolone, a prowadzący reumatolog może je dostosować w najlepszym interesie pacjentów. Badanie to nie ma zatem wpływu na rutynowe leczenie pacjentów. Jednoczesne przyjmowanie leków zostanie odnotowane i uwzględnione w ostatecznej analizie.

Kryteria wykluczenia: Pacjenci w wieku poniżej 18 lat lub niezdolni lub chętni do wyrażenia świadomej zgody, pacjenci rozpoczynający leczenie adalimumabem przed mniej niż pięcioma okresami półtrwania po przerwaniu wcześniejszej terapii anty-TNF.

Wielkość próby i statystyki: Wielkość próby obliczono na podstawie rozkładu i wariancji głównego wyniku, tj. liczby osteoklastów wytworzonych in vitro. Z populacji 51 zdrowych dawców w naszym laboratorium liczba wygenerowanych osteoklastów wyniosła 601,1 ± 156,8 osteoklastów/dołek (dane przedstawione na dorocznym spotkaniu Kanadyjskiego Stowarzyszenia Reumatologicznego w 2007 r., w druku w Journal of Rheumatology). Rozważaliśmy poziom istotności testu wynoszący 5% (α = 0,05) i moc 80%, aby wykryć różnicę co najmniej 100 osteoklastów / studzienkę między grupami (sparowany dwustronny test t), co doprowadziło łącznie do 22 pacjentów. Biorąc pod uwagę 10% stratę spowodowaną przyczynami technicznymi, wielkość próby ustalono na 25 pacjentów.

Metodologia

Próbki krwi: 50 ml krwi w heparynie zostanie pobrane od każdego pacjenta nie wcześniej niż 2 miesiące przed rozpoczęciem leczenia adalimumabem oraz 3 i 6 miesięcy po pierwszym podaniu leku (± 2 tygodnie). DAS-28, wyniki HAQ, choroby współistniejące i towarzyszące leki zostaną określone i zapisane w tym samym czasie, a zakodowane dane będą przechowywane w bezpiecznej bazie danych.

Badania osteoklastów:

Osteoklastogeneza: PBMC zostaną wyizolowane z 50 ml krwi za pomocą gradientu Ficoll-Hypaque, a liczba prekursorów CD14+ OC zostanie określona za pomocą FACS. Cała populacja PBMC zostanie umieszczona na 48-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych zawierających skrawek kości lub szkiełko, a komórki będą pozostawione do różnicowania przez 21 dni w obecności rekombinowanego RANKL (75 ng/ml) i M- płyn mózgowo-rdzeniowy (10 ng/ml). Komórki następnie utrwala się i barwi na aktywność TRAP i hematoksyliną. Liczba komórek TRAP+ zawierających trzy lub więcej jąder zostanie zliczona w każdym dołku. Dla każdego pacjenta zostaną użyte trzy powtórzenia. W równoległych dołkach komórki będą inkubowane w tych samych warunkach, ale w obecności adalimumabu w stężeniu porównywalnym do tego, jakie stwierdza się in vivo po traktowaniu.

Aktywność resorpcyjna OC: W testach resorpcji kości komórki różnicowane przez 21 dni na skrawkach kości będą barwione pod kątem TRAP i 0,2% błękitu toluidynowego. Powierzchnia resorpcji zostanie określona ilościowo przy użyciu programu do analizy obrazu, Simple PCI. Testy równoległe zostaną wykonane w obecności adalimumabu.

Analiza statystyczna:

Grupy przed i po interwencji zostaną porównane przy użyciu parametrycznych sparowanych testów dwustronnych dla zmiennych o rozkładzie normalnym oraz testów nieparametrycznych, gdy będzie to właściwe.

Oczekiwane wyniki

Badania te pozwolą określić, czy leczenie adalimumabem ma wpływ na liczbę krążących prekursorów osteoklastów, na generację osteoklastów oraz na aktywność resorpcyjną kości tych komórek. Pozwoli to również określić, czy adalimumab w stężeniach występujących in vivo może mieć bezpośredni wpływ na osteoklastogenezę i resorpcję kości u ludzi. Co być może ważniejsze, korelacja wyników osteoklastów z badanymi parametrami klinicznymi może pozwolić nam na wgląd w to, czy ostateczny wpływ na osteoklasty może korelować z odpowiedzią kliniczną na lek, wskazując na możliwy dodatkowy mechanizm działania adalimumabu w reumatoidalnym zapaleniu stawów.