Knogleresorption, osteoklastogenese og Adalimumab (BROCA)

Osteoklaster (OC'er) er celler, der er specialiseret i knoglenedbrydning, som deltager i knogle- og leddestruktion ved leddegigt (RA). Eksperimentelle modeller har klart vist, at OC'er er afgørende for lokal knogleresorption ved arthritis. Hos RANKL knockout-mus(1; 2), hos rotter, der modtager OPG(3-6) eller i c-fos(-/-) hTNF-transgene mus(7) fører induktion af arthritis til inflammation, men ikke til knogleerosion. Systemisk osteoporose er en vigtig komorbiditet ved RA(8; 9). Øget systemisk knogleresorption på grund af OC-aktivering forekommer selv i tidlig (< 2 år) RA og korrelerer med sygdomsaktivitet(10). Bisfosfonater er effektive til at forhindre systemisk knogletab ved inflammatoriske sygdomme, men af ​​ukendte årsager synes de ikke at påvirke periartikulær knogleerosion og ledødelæggelse. Endelig synes en systemisk faktor, der påvirker osteoklastogenese, at være til stede i RA, som vist ved en øget dannelse af OC'er fra knoglemarv hos patienter med svær arthritis sammenlignet med kontroller(11).

TNF-alfa er en vigtig patologisk mediator ved RA. Det kan inducere knogleresorption enten direkte, stimulerende osteoklastogenese(12; 13) eller indirekte, ved at påvirke RANKL, OPG og prostaglandinproduktion af osteoblaster(14; 15). Disse veje kan være vigtige for patofysiologien af ​​flere sygdomme såsom paradentose, leddegigt og osteoporose(16; 17). Hos mus øger TNF-alfa antallet af osteoklastprækursorer in vivo, men dets rolle kan dog være mere kompleks og implicere også osteoklastogenese-hæmmende mekanismer(18; 19); faktisk under visse forhold kan TNF-alfa nedsætte osteoklastogenese(20), så in vivo-effekten af ​​at blokere TNF kan være svær at forudsige ud fra disse modeller.

Anti-TNF-midler reducerer knogledestruktion ved RA, men det er ikke klart, hvordan denne effekt opnås, da TNF, som beskrevet i det foregående afsnit, har vist sig at have antagonistiske virkninger i osteoklastdannelse og -aktivitet. Desuden er lidt kendt om effekten af ​​anti-TNF-terapi på osteoklastbiologi hos mennesker.

Arbejdshypotese

Dette projekt er baseret på to forskellige, men nært beslægtede hypoteser:

1. Behandling med anti-TNF-midler (Adalimumab i dette tilfælde) kan reducere antallet af cirkulerende osteoklastprækursorer, in vitro osteoklastogenese og in vitro knogleresorption.
2. Tilsætning af Adalimumab til dyrkningsmediet, der bruges til at differentiere osteoklaster in vitro, kan hæmme osteoklastogenese og knogleresorption.

Mål

Osteoklastisk knogleresorption afhænger både af evnen til at generere osteoklaster (osteoklastogenese) og af individuel osteoklastaktivitet. Vores mål er at undersøge effekten af ​​anti-TNF-terapi på antallet af osteoklastprækursorer i det perifere blod hos patienter med RA, på in vitro osteoklastogenese og på osteoklastaktivitet før og under behandlingen af ​​patienter med RA med Adalimumab.

Forskningsplan

Forsøgsdesign: Som et klinisk spor, der sigter mod at studere effekten af ​​anti-TNF-behandling på osteoklastogenese og osteoklastaktivitet, vil vi studere en kohorte af patienter med RA før og på to tidspunkter efter påbegyndelse af behandlingen, 3 og 6 måneder, således at hver patienten vil være hans/hendes egen kontrol (før/efter undersøgelse). De to tidspunkter efter introduktion af terapien er nødvendige af to årsager: 1) Det tidspunkt, hvor en eventuel effekt på de undersøgte parametre kan nå sit højdepunkt, kendes ikke, og 2) For at sikre, at de målte parametre er stabile over tid.

Resultater:

Primære resultater vil være forskellen i følgende parametre før og efter behandling med Adalimumab (3 og 6 måneder):

1. antallet af osteoklastprecursor (CD14+) celler i det perifere blod
2. antallet af osteoklaster dannet in vitro
3. mængden af ​​knogleresorption in vitro

Sekundære resultater:

1. Parallelle in vitro differentieringsassays (antal osteoklaster genereret og mængden af ​​knogleresorption) i nærvær af eksogent Adalimumab i det koncentrationsområde, der findes i plasma fra behandlede patienter for at påvise en direkte effekt af medicinen in vitro i osteoklastogenese.
2. sygdomsaktivitet defineret som en DAS28-score (21; 22)
3. Ændring i funktionel status af M-HAQ (23)

Patientkohorte:

Inklusionskriterier: Patienter, der opfylder ACR-kriterierne for RA(24) og har modtaget en recept på Adalimumab fra en reumatolog ved Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Patienter, der har modtaget andre anti-TNF-terapier, er først berettigede efter 5 halveringstider af den tidligere medicin. Patienter skal være villige til at underskrive et informeret samtykke. Samtidig medicinering, bortset fra anti-TNF'er og andre biologiske midler, er tilladt, og den behandlende reumatolog kan tilpasse det efter patienternes bedste. Denne undersøgelse har således ingen indflydelse på den rutinemæssige behandling af patienterne. Samtidig medicinering vil blive registreret og overvejet i den endelige analyse.

Eksklusionskriterier: Patienter under 18 år eller ikke i stand til eller villige til at give informeret samtykke, patienter, der starter med Adalimumab mindre end fem halveringstider efter afbrydelse af en tidligere anti-TNF-behandling.

Prøvestørrelse og statistik: Prøvestørrelsen blev beregnet ud fra fordelingen og variansen af ​​det primære resultat, dvs. antallet af osteoklaster genereret in vitro. Fra en population på 51 normale donorer i vores laboratorium var antallet af genererede osteoklaster 601,1 ± 156,8 osteoklaster/brønd (data præsenteret på det årlige møde i 2007 i Canadian Rheumatology Association, under tryk i Journal of Rheumatology). Vi betragtede et testsignifikansniveau på 5 % (α = 0,05) og styrken på 80 % til at detektere en forskel på mindst 100 osteoklaster/brønd mellem grupperne (parret to-halet t-test), hvilket førte til i alt 22 patienter. I betragtning af et tab på 10 % på grund af tekniske årsager blev stikprøvestørrelsen fastsat til 25 patienter.

Metodik

Blodprøver: 50 ml blod i heparin vil blive indsamlet fra hver patient højst 2 måneder før påbegyndelse af behandling med Adalimumab og 3 og seks måneder efter den første administration af lægemidlet (± 2 uger). DAS-28, HAQ-score, komorbiditeter og samtidig medicinering vil blive bestemt og registreret på samme tidspunkter, og de kodede data gemmes i en sikker database.

Osteoklastundersøgelser:

Osteoklastogenese: PBMC'er vil blive isoleret fra 50 ml blod ved Ficoll-Hypaque gradient, og antallet af CD14+ OC precursorer vil blive bestemt af FACS. Hele populationen af ​​PBMC'er udplades i vævskulturplader med 48 brønde indeholdende en knogleskive eller et objektglas, og cellerne får lov til at differentiere i 21 dage i nærværelse af rekombinant RANKL (75 ng/ml) og M- CSF (10 ng/ml). Cellerne fikseres derefter og farves for TRAP-aktivitet og med hæmatoxylin. Antallet af TRAP+-celler, der indeholder tre eller flere kerner, tælles i hver brønd. Der vil blive brugt triplikater for hver patient. I parallelle brønde vil cellerne blive inkuberet under de samme betingelser, men i nærværelse af Adalimumab i en koncentration, der kan sammenlignes med den, der findes in vivo efter behandling.

OC-resorptiv aktivitet: Til knogleresorptionsassays vil celler, der er differentieret i 21 dage på knogleskiver, blive farvet for TRAP og 0,2 % toluidinblåt. Resorptionsoverfladearealet vil blive kvantificeret ved hjælp af billedanalyseprogrammet Simple PCI. Parallelle analyser vil blive udført i nærværelse af Adalimumab.

Statistisk analyse:

Grupperne før og efter intervention vil blive sammenlignet ved hjælp af parametriske parrede to-halede test for variablerne med en normalfordeling og med ikke-parametriske test, når det er relevant.

Forventede resultater

Disse undersøgelser vil give os mulighed for at afgøre, om behandling med Adalimumab har en effekt på antallet af cirkulerende osteoklastprecursorer, på dannelsen af ​​osteoklaster og på disse cellers knogleresorberende aktivitet. Det vil også gøre det muligt at bestemme, om Adalimumab, i koncentrationer fundet in vivo, kan have en direkte indvirkning på human osteoklastogenese og knogleresorption. Måske endnu vigtigere, korrelation af osteoklastresultaterne med de undersøgte kliniske parametre kan give os et indblik i, hvorvidt en eventuel effekt på osteoklaster kan korrelere med den kliniske respons på medicinen, hvilket indikerer en mulig yderligere virkningsmekanisme for Adalimumab ved reumatoid arthritis.