培養赤血球：生体内寿命研究 (GRc2008)

1. 一般論

   1.1 cRBC の臨床グレードの生産 この研究では、cRBC は有効成分であり、放射性クロム標識を施した最終製品でもあります。

   再注入される 5x109 cRBC の量は、寿命を測定するのに十分な感度を得るために 2500 から 5000 kBq の間にある放射能の量を持つ必要性によって決定されます。

   1.2 検証された仮説 cRBC は in vitro でネイティブ RBC のすべての機能特性を備えているため、in vivo で実行可能であるという仮説が立てられています。

   この生存率は、寿命を測定することによって評価されます。 これは、報告されているネイティブ RBC の寿命、つまり 30+3 日と比較されます。

2. 研究の目的

   2.1 主な目的 培養赤血球の in vivo での寿命に関する研究。

   2.2 評価基準

   2.2.1 プリンシパル: 主要な基準は、測定された cRBC の寿命です。 これは、報告されているネイティブ RBC の寿命、つまり 30+3 日と比較されます。

   この研究では、cRBC のコホートを標識する必要があります。投与後、この cRBC のコホートは循環血液中で老化し、「寿命」の終わりに消失します。 結果は次のように解釈されます。

   - 最初の 3 つの血液サンプルの放射能が (減衰の補正後) 一定のままである場合、これは早期の細胞破壊がないことを支持する証拠と見なされます。

   次の 3 つのサンプルは後で採取されます [その後 30 日間を限度として、クロム 51 の崩壊によりサンプルの放射能の測定ができなくなります。1.2% の割合で細胞からクロムが除去されます。非常に低い放射能に対する放射能カウントの精度の欠如]。 cRBC の寿命は 33 日よりも長いと結論付けられます。

   - 最初の 3 つのサンプルで、放射能が大幅に減少し、参照曲線よりも早く減少した場合、他の 3 つのサンプルを近づけて採取することで、cRBC の平均寿命を推定できます。

3. 実験計画

   3.1 試験の種類 臨床的フィージビリティ アッセイ。

   3.2 実験計画

   調査は 4 つのフェーズで実施されます。

   1. 健康で慈悲深いドナーから得られた HSC 移植片から単離された単核細胞から、1 mL の血液に相当する、すなわち 5x109 の除核された RBC を in vitro で生成し、
   2. 赤血球の寿命を研究するために使用される古典的なプロトコルに従って、これらの cRBC を 51Cr で標識し、
   3. 同じドナーへの自家cRBCの再注入、
   4. 注入された細胞の半減期を測定するために、最長 33 日間の受信者のフォローアップ。
4. 受信者の特徴 4.1 研究集団の説明 患者ではなく健康なボランティアで研究を実施するという選択は、溶血につながる可能性のある状況を回避する健康な生理学的状況を持つ必要性に基づいています。 プロトコルは成長因子による動員を必要とするため、末梢幹細胞 (PSC) のドナーは G-CSF を受け取ります。

健康なドナーが G-CSF に不必要にさらされるのを避けるために、PSC の家族内ドナーの中から任意の受信者が募集されます。

HSC の動員のコンテキストでは、彼らは 10 μ g/kg 体重の用量で G-CSF の 5 日間の皮下注射を受けます。

4.1.1 細胞アフェレーシスによる単核細胞の採取

出発物質の特徴:

末梢血造血幹細胞は、患者の移植片が患者の体重1 kgあたり7x106以上のCD34 +細胞を含まない限り、培養RBCの産生のために採取されません。同種移植を受けた患者の。 したがって、研究プロトコルは、患者のチャンスを失うことはありません。

4.1.2 プロトコルのための CD34+ 細胞の分離 研究に使用される CD34+ 細胞は、Isolex® システムを使用してポジティブ免疫磁気選択カラムで選択されます。 システムが正常に機能するには、最低でも 45x106 個の CD34+ 細胞が必要です。 これらの制限要因により、G-CSF で動員された幹細胞を開始材料として使用する必要があります。 研究のためにこのサンプルを取り出した後、移植片には患者の体重 1 kg あたり 7x106 個の CD34+ 細胞が含まれている必要があります。

選択後の出発材料は、免疫磁気選択によって精製された臨床グレードの CD34 + 細胞で構成されます。 50% 以上の CD34 + 細胞の純度は、免疫磁気選択後に取得する必要があります。 生存細胞の割合は、トリパン ブルーで染色することによって決定されます。 精製された CD34+ 細胞は、10% DMSO を含む 4% アルブミン溶液で凍結され、1x106 CD34+ 細胞を含む 2.5 mL クリオチューブで調整されます。 解凍後、細胞の生存率は 50% 以上である必要があります。

0 日目に培養液に播種するには、最低でも 100 万個の生存 CD34+ 細胞が必要です。

4.1.3 cRBC の生物学的特性

有効成分はフィルター処理された cRBC であり、最終生成物である cRBC は 51Cr で標識されています。 ラベル付けの直後に製品を再注入する必要があるため、特性評価は有効成分で実行され、次の要素が含まれます。

有効成分は、次のもので構成されている必要があります。

1. によって特徴付けられるRBC:

   • それらの形態 (May-Grunwald-Giemsa で染色されたスライド上)、
   • それらのヘモグロビン含有量 (Sysmex XE-2100 自動装置で測定された MHC > 25 pg) (3.2.S.4.3 を参照);
2. 好酸性赤芽球 < 1.2% (スライド上でカウントされた > 10,000 細胞中);
3. スライド上でカウントされた> 10,000個の細胞で、他のすべての細胞タイプを除外します。

4.1.4 有効成分の十分な基準 (cRBC)

以下の特性を示す場合、製品にはクロムのラベルが付けられます。

• MHC > 25 pg の 5 ～ 10x109 RBC、
• < 1.2%の好酸性赤芽球、
• 白血球の欠如。 残りの微生物学的コントロールは事後的に知られています。

4.1.5 クロム51による標識

このステップは、核医学クリニックで行われます。 ラベル付けが行われます：

• cRBCの懸濁液を使用して、
• [51Cr] クロム酸ナトリウムの無菌溶液は、キャリブレーションで 37 MBq/mL の活性を示します。

標識手順自体は、臨床的に無菌条件下で行われます。 懸濁液は、ストッパーで閉じた 2 mL 注射器を使用して 0.3 mL 画分 (注射前の注射器の 51 Cr 活性の測定に関連する制約) で注入されます。 再注入される最大量は、静脈経路で 5 mL になります。

4.1.6 51Cr でラベル付けされた最終製品の十分な基準

標識された製品は、以下の特徴を示す場合、健康なボランティアに注射されます。

• 2,500 KBq (最小) と 5,000 KBq (最大) の間の 51Cr アクティビティ、
• 細胞に結合していない 51Cr が存在しない。

4.1.7 レシーバーへの注入 このステップは、幹細胞採取後 2 か月以内に行われます。 規制上の理由により、放射性医薬品の投与用に予約された部屋で、核医学クリニックにあり、準備研究室に隣接する、1 mL のラベル付き cRBC の直接静脈内注射。

監視期間が終了するまでの静脈経路の維持。 注射後 T+1 時間および T+3 時間に、肘の屈曲部での静脈穿刺による EDTA への 10 mL の血液の 2 つのサンプルの収集。

クリニックからの退院基準：発熱または震えがないこと、正常な血圧および正常な臨床検査。

注射後の監視の合計期間: 4 時間。

4.2 cRBC の寿命測定のための予定の計画 肘の屈曲部での静脈穿刺による 10 mL のサンプルの収集とレシーバーのフォローアップは、CIC St Antoine で実施されます。

核医学クリニックへのチューブの転送。

• 3 番目のサンプルは、注射後 T+24 時間で採取されます。
• 次の 3 つは、最初のサンプルから推定される減衰に従って選択された日に採取されます (注射後 T+48 時間から T+30 日の間)。

サンプリングの固定日付の確立の欠如は、cRBC のこの均一な集団の動力学に適応する必要性によって正当化されますが、現時点では不明です。

診察のたびに臨床検査が行われます。 測定を実行した後、サンプルは破棄されます。

結論として、このアプローチにはいくつかの利点があります。

1. 研究の唯一の目的のために、成長因子、G-CSFを健康なボランティアに注射することを避けます.
2. 自己の状況は、免疫学的リスクおよび感染病原体の伝染のリスクを回避します。
3. 51Cr は、エネルギー 320 keV のガンマ線放射体であり、放射期間は 27.7 日です。 この研究の結果である照射には、測定可能なリスクは含まれていません。 受信者に対しても、受信者と接触する人々に対しても、特別な放射線防護予防措置を想定する必要はありません。