Dyrkede røde blodlegemer: Levetid in vivo undersøgelse (GRc2008)

1. GENERELT

   1.1 Klinisk kvalitet produktion af cRBC I denne undersøgelse er cRBC både det aktive stof og det endelige produkt, der udsættes for radioaktiv krommærkning.

   Mængden af ​​5x109 cRBC, der skal reinjiceres, bestemmes af nødvendigheden af ​​at have en mængde radioaktivitet på mellem 2500 og 5000 kBq for at have tilstrækkelig følsomhed til at måle levetiden.

   1.2 Testet hypotese Da cRBC'en in vitro har alle de funktionelle egenskaber af native RBC, antages det, at de vil være levedygtige in vivo.

   Denne levedygtighed vil blive evalueret ved at måle deres levetid. Det vil blive sammenlignet med den rapporterede levetid for native RBC, dvs. 30+3 dage.

2. UNDERSØGELSENS MÅL

   2.1 Hovedformål Undersøgelse af levetiden in vivo for dyrkede røde blodlegemer.

   2.2 Evalueringskriterier

   2.2.1 Principal: Hovedkriteriet er den målte levetid for cRBC'en. Det vil blive sammenlignet med den rapporterede levetid for native RBC, dvs. 30+3 dage.

   Undersøgelsen involverer mærkning af en kohorte af cRBC: efter administration vil denne kohorte af cRBC ældes i det cirkulerende blod og derefter forsvinde ved slutningen af ​​dens "levetid". Resultaterne vil blive fortolket på følgende måde:

   - hvis radioaktiviteten af ​​de første 3 blodprøver forbliver konstant (efter korrektion for henfald), vil dette blive taget som bevis til fordel for fravær af for tidlig celledestruktion.

   Følgende 3 prøver udtages senere [inden for grænsen på 30 dage, hvorefter måling af prøvernes radioaktivitet ikke længere vil være mulig på grund af henfaldet af chrom 51, eliminering af chrom fra cellerne med en hastighed på 1,2 % dag og manglende præcision af det radioaktive antal for meget lave aktiviteter]. Man vil konkludere, at levetiden for cRBC er over 33 dage.

   - hvis radioaktiviteten i de første 3 prøver aftager væsentligt og tidligere end på referencekurverne, vil tre andre prøver, der tages tæt på hinanden, gøre det muligt at estimere den gennemsnitlige levetid for cRBC'en.

3. EKSPERIMENTEL PLAN

   3.1 Undersøgelsestype Klinisk gennemførlighedsanalyse.

   3.2 Forsøgsplan

   Undersøgelsen vil blive gennemført i 4 faser:

   1. produktion in vitro af ækvivalenten til 1 ml blod, dvs. 5x109 enucleated RBC, fra mononukleære celler isoleret fra et HSC-transplantat opnået fra en sund velvillig donor,
   2. mærkning af disse cRBC med 51Cr, ifølge den klassiske protokol, der bruges til at studere levetiden for røde blodlegemer,
   3. reinjektion af det autologe cRBC i den samme donor,
   4. opfølgning af modtageren i en maksimal varighed på 33 dage for at måle halveringstiden af ​​de injicerede celler.
4. MODTAGERNES KARAKTERISTIKA 4.1 Beskrivelse af undersøgelsespopulationen Valget af at udføre undersøgelsen hos raske frivillige og ikke hos patienter er baseret på nødvendigheden af ​​at have en sund fysiologisk kontekst og undgå enhver situation, der kan føre til hæmolyse. Da protokollen kræver mobilisering med en vækstfaktor, modtager donorerne af perifere stamceller (PSC) G-CSF.

De frivillige modtagere vil blive rekrutteret blandt intra-familiære donorer af PSC for at undgå unødvendig eksponering af en rask donor for G-CSF.

I forbindelse med mobiliseringen af ​​HSC vil de i 5 dage modtage subkutane injektioner af G-CSF i en dosis på 10 µg/kg legemsvægt.

4.1.1 Indsamling af mononukleære celler ved cytaferese

Udgangsmaterialets egenskaber:

Hæmatopoietiske stamceller fra perifert blod tages ikke til produktion af dyrkede røde blodlegemer, medmindre transplantatet, der er bestemt til patienten, indeholder > 7x106 CD34+-celler/kg legemsvægt af patientmodtageren, idet celledosis i litteraturen er fastlagt som tilstrækkelig til at rekonstituere hæmatopoiesen af en patient, der modtager et allogent transplantat. Forskningsprotokollen vil således ikke medføre noget tab af chance for patienten.

4.1.2 Isolering af CD34+-celler til protokollen De CD34+-celler, der skal bruges til forskning, vil blive udvalgt på en positiv immunomagnetisk selektionssøjle ved hjælp af et Isolex®-system. Et minimum af 45x106 CD34+ celler er nødvendigt for at systemet fungerer godt. Disse begrænsende faktorer forpligter os til at bruge stamceller mobiliseret med G-CSF som udgangsmateriale. Efter fjernelse af denne prøve til undersøgelsen skal transplantatet indeholde mindst 7x106 CD34+-celler/kg kropsvægt af patienten.

Udgangsmaterialet efter selektion vil bestå af CD34+-celler af klinisk kvalitet oprenset ved immunomagnetisk selektion. En renhed på mere end 50 % CD34+ celler bør opnås efter immunomagnetisk selektion. Procentdelen af ​​levedygtige celler vil blive bestemt ved farvning med trypanblåt. De oprensede CD34+-celler vil blive frosset i en 4% albuminopløsning indeholdende 10% DMSO og konditioneret i 2,5 ml kryorør indeholdende 1x106 CD34+-celler. Efter optøning bør cellelevedygtigheden være mere end 50%.

Mindst 1 million levedygtige CD34+-celler er nødvendige for podning i kultur på dag 0.

4.1.3 Biologisk karakterisering af cRBC

Det aktive princip er filtreret cRBC og slutproduktet cRBC mærket med 51Cr. Da produktet skal reinjiceres umiddelbart efter mærkning, vil karakteriseringen blive udført på det aktive princip og vil omfatte følgende elementer:

Det aktive princip bør bestå af:

1. RBC karakteriseret ved:

   • deres morfologi (på objektglas farvet med May-Grunwald-Giemsa),
   • deres hæmoglobinindhold (MHC > 25 pg målt i en Sysmex XE-2100 automat) (se 3.2.S.4.3);
2. acidofile erythroblaster < 1,2 % (i > 10.000 celler talt på et objektglas);
3. med udelukkelse af alle andre celletyper i > 10.000 celler talt på et objektglas.

4.1.4 Tilstrækkelige kriterier for det aktive princip (cRBC)

Produktet vil blive mærket med krom, hvis det har følgende egenskaber:

• 5 til 10x109 RBC med MHC > 25 pg,
• < 1,2 % acidofile erythroblaster,
• fravær af leukocytter. De resterende mikrobiologiske kontroller vil være kendt efterfølgende.

4.1.5 Mærkning med krom 51

Dette trin vil blive udført i den nuklearmedicinske klinik. Mærkning udføres:

• ved at bruge en suspension af cRBC,
• og en steril opløsning af [51Cr] natriumchromat med en aktivitet på 37 MBq/ml ved kalibrering.

Selve mærkningsproceduren udføres under klinisk sterile forhold. Suspensionen injiceres i 0,3 ml fraktioner (begrænsning forbundet med måling af 51Cr-aktiviteten af ​​sprøjterne før injektion) under anvendelse af 2 ml sprøjter lukket med en prop. Det maksimale volumen, der geninjiceres, vil være 5 ml intravenøst.

4.1.6 Tilstrækkelige kriterier for det endelige produkt mærket med 51Cr

Det mærkede produkt vil blive injiceret i den raske frivillige, hvis det udviser følgende egenskaber:

• 51Cr aktivitet mellem 2.500 KBq (minimum) og 5.000 KBq (maksimum),
• et fravær af 51Cr ikke bundet til celler.

4.1.7 Injektion i modtagere Dette trin vil finde sted inden for 2 måneder efter stamcelleindsamling. Direkte intravenøs injektion af mærket cRBC i et volumen på 1 ml, i et rum, der er reserveret til administration af radioaktive lægemidler, beliggende i den nuklearmedicinske klinik og ved siden af ​​præparatlaboratoriet af regulatoriske årsager.

Vedligeholdelse af en venøs rute indtil slutningen af ​​overvågningsperioden. Indsamling af 2 prøver af 10 mL blod i EDTA ved venøs punktering ved bøjning af albuen, ved T+1t og T+3t efter injektion.

Kriterier for udskrivning fra klinikken: fravær af feber eller kuldegysninger, normalt blodtryk og normal klinisk undersøgelse.

Samlet varighed af post-injektionsovervågningen: 4 timer.

4.2 Planlægning af aftaler for måling af levetiden for cRBC Indsamling af 10 ml prøver ved venøs punktering ved bøjningen af ​​albuen og opfølgning af modtagerne vil blive udført på CIC St Antoine.

Overførsel af rørene til nuklearmedicinsk klinik.

• Den tredje prøve tages T+24 timer efter injektion.
• De følgende 3 vil blive taget på dage valgt i henhold til det estimerede henfald fra de første prøver (mellem T+48 timer og T+30 dage efter injektion).

Manglen på etablering af faste datoer for prøveudtagning er begrundet i nødvendigheden af ​​at tilpasse sig kinetikken for denne homogene population af cRBC, som på nuværende tidspunkt er ukendt.

En klinisk undersøgelse vil blive udført ved hver aftale. Efter udførelse af målingerne vil prøverne blive destrueret.

Afslutningsvis har denne tilgang flere fordele:

1. Det undgår at injicere en vækstfaktor, G-CSF, i en sund frivillig med henblik på undersøgelsens eneste formål.
2. Den autologe situation undgår enhver immunologisk risiko og enhver risiko for overførsel af smitsomme stoffer.
3. 51Cr er en emitter af gammastråling med energi 320 keV og har en radioaktiv periode på 27,7 dage. Bestrålingen fra denne undersøgelse indebærer ingen målbar risiko. Der skal ikke tages særlige strålebeskyttende forholdsregler, hverken for modtageren eller for dem, der er i kontakt med ham.