Tenyésztett vörösvérsejtek: Élettartam in vivo vizsgálat (GRc2008)

1. ÁLTALÁNOSSÁGOK

   1.1 A cRBC klinikai minőségű előállítása Ebben a tanulmányban a cRBC a hatóanyag és a radioaktív krómjelölésnek alávetett végtermék is.

   Az 5x109 cRBC újrainjektálandó mennyiségét az határozza meg, hogy a radioaktivitás mennyisége 2500 és 5000 kBq között legyen, hogy az élettartam mérésére elegendő érzékenység legyen.

   1.2 A tesztelt hipotézis Mivel a cRBC-k in vitro rendelkeznek a natív vörösvértestek összes funkcionális jellemzőjével, feltételezhető, hogy in vivo életképesek lesznek.

   Ezt az életképességet az élettartamuk mérésével értékelik. Összehasonlítják a natív vörösvértestek bejelentett élettartamával, azaz 30+3 nap.

2. A VIZSGÁLAT CÉLKITŰZÉSEI

   2.1 Fő célkitűzés A tenyésztett vörösvértestek élettartamának in vivo vizsgálata.

   2.2 Értékelési kritériumok

   2.2.1 Alap: A fő kritérium a cRBC mért élettartama. Összehasonlítják a natív vörösvértestek bejelentett élettartamával, azaz 30+3 nap.

   A tanulmány egy cRBC csoport jelölését foglalja magában: a beadás után ez a cRBC csoport elöregszik a keringő vérben, majd eltűnik "élettartamának" végén. Az eredményeket a következőképpen értelmezzük:

   - ha az első 3 vérminta radioaktivitása állandó marad (a bomlás korrekciója után), ez bizonyítéknak tekintendő a korai sejtpusztulás hiánya mellett.

   Az alábbi 3 minta vételére később kerül sor [30 napon belül, amely után a minták radioaktivitásának mérése a króm 51 bomlása, a króm sejtekből 1,2%-os kiürülése miatt már nem lehetséges. naponta és a radioaktív számok pontosságának hiánya nagyon alacsony aktivitás esetén]. Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a cRBC élettartama meghaladja a 33 napot.

   - ha az első 3 mintában a radioaktivitás jelentősen és korábban, mint a referenciagörbéken csökken, három másik, egymáshoz közel vett minta lehetővé teszi a cRBC átlagos élettartamának becslését.

3. KÍSÉRLETI TERV

   3.1 A vizsgálat típusa Klinikai megvalósíthatósági vizsgálat.

   3.2 Kísérleti terv

   A tanulmány 4 szakaszban fog megvalósulni:

   1. egészséges, jóindulatú donorból származó HSC graftból izolált mononukleáris sejtekből 1 ml vérnek megfelelő, azaz 5x109 magvatlan vörösvértest in vitro előállítása,
   2. ezeknek a cRBC-knek a jelölése 51Cr-rel, a vörösvértestek élettartamának tanulmányozására használt klasszikus protokoll szerint,
   3. az autológ cRBC újrainjektálása ugyanabba a donorba,
   4. a befogadó nyomon követése legfeljebb 33 napig az injektált sejtek felezési idejének mérésére.
4. A BEVEZETÉSEK JELLEMZŐI 4.1 A vizsgálati populáció leírása A vizsgálat egészséges önkénteseken és nem betegeken történő elvégzésének megválasztása azon alapul, hogy egészséges élettani környezetre van szükség, elkerülve minden olyan helyzetet, amely hemolízishez vezethet. Mivel a protokoll növekedési faktorral történő mobilizálást igényel, a perifériás őssejtek (PSC) donorai G-CSF-et kapnak.

Az önkéntes befogadókat a PSC családon belüli donorai közül fogják felvenni, hogy elkerüljék az egészséges donor G-CSF-nek való szükségtelen kitettségét.

A HSC mobilizálásával összefüggésben 5 napon át szubkután G-CSF injekciót kapnak 10 µg/ttkg dózisban.

4.1.1 Mononukleáris sejtek gyűjtése citaferézissel

A kiindulási anyag jellemzői:

A perifériás vérből származó vérképző őssejteket nem veszik fel tenyésztett vörösvértestek előállításához, kivéve, ha a betegnek szánt graft több mint 7x106 CD34+ sejtet tartalmaz a befogadó beteg testtömeg-kilogrammonként, és az irodalomban megállapított sejtdózis elegendő a vérképzés helyreállításához. egy allogén graftot kapott betegről. Így a kutatási protokoll nem jár esélyveszteséggel a páciens számára.

4.1.2 CD34+ sejtek izolálása a protokollhoz A kutatáshoz használt CD34+ sejteket pozitív immunmágneses szelekciós oszlopon, Isolex® rendszerrel választjuk ki. A rendszer megfelelő működéséhez legalább 45x106 CD34+ sejt szükséges. Ezek a korlátozó tényezők arra köteleznek bennünket, hogy kiindulási anyagként G-CSF-fel mobilizált őssejteket használjunk. Ennek a mintának a vizsgálathoz való eltávolítása után a graftnak legalább 7x106 CD34+ sejtet kell tartalmaznia a beteg testtömeg-kilogrammonként.

A szelekció utáni kiindulási anyag immunmágneses szelekcióval tisztított klinikai minőségű CD34+ sejtekből áll. Az immunmágneses szelekciót követően a CD34+ sejtek 50%-nál nagyobb tisztaságát kell elérni. Az életképes sejtek százalékos arányát tripánkékkel történő festéssel határozzuk meg. A tisztított CD34+ sejteket 10% DMSO-t tartalmazó 4%-os albuminoldatban lefagyasztjuk, és 1x106 CD34+ sejtet tartalmazó 2,5 ml-es kriocsövekben kondicionáljuk. Felolvasztás után a sejtek életképességének 50%-nál nagyobbnak kell lennie.

Legalább 1 millió életképes CD34+ sejt szükséges a tenyészet 0. napon történő beoltásához.

4.1.3 A cRBC biológiai jellemzése

A hatóanyag a szűrt cRBC, a végtermék cRBC pedig 51Cr-vel jelölt. Mivel a készítményt a címkézés után azonnal újra be kell fecskendezni, a jellemzést a hatóanyagon végzik el, és a következő elemeket kell tartalmaznia:

A hatóanyagnak a következőkből kell állnia:

1. A vörösvértestek jellemzői:

   • morfológiájuk (May-Grunwald-Giemsa-val festett tárgylemezeken),
   • hemoglobintartalmuk (MHC > 25 pg Sysmex XE-2100 automatával mérve) (lásd 3.2.S.4.3);
2. acidofil eritroblasztok < 1,2% (>10 000 sejtben, tárgylemezen számolva);
3. az összes többi sejttípus kizárásával a tárgylemezen számolt > 10 000 sejtben.

4.1.4 A hatóanyag (cRBC) megfelelő kritériumai

A terméket krómmal kell címkézni, ha az alábbi jellemzőkkel rendelkezik:

• 5-10x109 vörösvértestek MHC-vel > 25 pg,
• < 1,2% acidofil eritroblaszt,
• a leukociták hiánya. A fennmaradó mikrobiológiai kontrollokat utólag ismerjük meg.

4.1.5 Címkézés krómmal 51

Ezt a lépést a nukleáris medicina klinikán hajtják végre. A címkézést:

• cRBC szuszpenzió felhasználásával,
• és [51Cr] nátrium-kromát steril oldata, amelynek aktivitása kalibráláskor 37 MBq/ml.

Maga a címkézési eljárás klinikailag steril körülmények között történik. A szuszpenziót 0,3 ml-es frakciókban fecskendezik be (a fecskendők 51Cr-aktivitásának méréséhez kötődő kényszer az injekció előtt) 2 ml-es, dugóval lezárt fecskendőkkel. Az újrainjektált maximális térfogat 5 ml intravénás úton.

4.1.6 Az 51Cr címkével ellátott végtermék megfelelő kritériumai

A címkézett terméket az egészséges önkéntesbe fecskendezik be, ha az alábbi jellemzőkkel rendelkezik:

• 51Cr aktivitás 2500 KBq (minimum) és 5000 KBq (maximum) között,
• a sejtekhez nem kötődő 51Cr hiánya.

4.1.7 Injekció a vevőkészülékekbe Ez a lépés az őssejtgyűjtést követő 2 hónapon belül megtörténik. Jelzett cRBC közvetlen intravénás befecskendezése 1 ml-es térfogatban, a radioaktív gyógyszerek beadására fenntartott helyiségben, a nukleáris medicina klinikáján és az előkészítő laboratórium mellett, szabályozási okokból.

A vénás útvonal fenntartása a megfigyelési időszak végéig. 2 db 10 ml-es vérminta gyűjtése EDTA-ba vénás punkcióval a könyökhajlatban, az injekciót követő T+1 és T+3 órában.

A klinikáról való elbocsátás kritériumai: láz vagy hidegrázás hiánya, normál vérnyomás és normál klinikai vizsgálat.

Az injekció beadása utáni megfigyelés teljes időtartama: 4 óra.

4.2 A cRBC élettartamának mérésére vonatkozó időpontok megtervezése 10 ml-es minták vétele vénás punkcióval a könyökhajlatban és a vevők követése a CIC St Antoine-ban történik.

A csövek átadása a nukleáris medicina klinikára.

• A harmadik mintát az injekció után 24 órával veszik.
• A következő 3-at az első mintákból becsült bomlási idő szerint választott napokon veszik (T+48h és T+30 nappal az injekció után).

A rögzített mintavételi időpontok meghatározásának hiányát az indokolja, hogy alkalmazkodni kell a cRBC homogén populációjának kinetikájához, amely jelenleg nem ismert.

Minden találkozó alkalmával klinikai vizsgálatra kerül sor. A mérések elvégzése után a mintákat megsemmisítjük.

Összefoglalva, ennek a megközelítésnek számos előnye van:

1. A vizsgálat egyetlen célja érdekében elkerüli, hogy egy egészséges önkéntesbe növekedési faktort, a G-CSF-et fecskendezzenek be.
2. Az autológ helyzet elkerüli az immunológiai kockázatot és a fertőző ágensek átvitelének kockázatát.
3. Az 51Cr 320 keV energiájú gamma-sugárzást bocsát ki, radioaktív periódusa 27,7 nap. Az ebből a vizsgálatból származó besugárzás nem jár mérhető kockázattal. Nem szükséges különösebb sugárvédelmi óvintézkedést előirányozni sem a vevő, sem a vele érintkezők számára.