배양 적혈구 : 생체 내 수명 연구 (GRc2008)

1. 일반 사항

   1.1 cRBC의 임상 등급 생산 이 연구에서 cRBC는 활성 성분이자 방사성 크롬 표지가 적용된 최종 제품입니다.

   재주입되는 5x109 cRBC의 양은 수명을 측정하기에 충분한 감도를 갖기 위해 2500~5000 kBq의 방사능 양을 가질 필요성에 의해 결정됩니다.

   1.2 테스트된 가설 cRBC는 시험관 내에서 천연 RBC의 모든 기능적 특성을 가지고 있기 때문에 생체 내에서 생존할 수 있을 것이라는 가설을 세웁니다.

   이 생존력은 수명을 측정하여 평가됩니다. 보고된 원시 RBC의 수명, 즉 30+3일과 비교됩니다.

2. 연구 목적

   2.1 배양된 적혈구의 생체 내 수명에 대한 주요 목적 연구.

   2.2 평가기준

   2.2.1 원칙: 주요 기준은 cRBC의 측정된 수명입니다. 보고된 원시 RBC의 수명, 즉 30+3일과 비교됩니다.

   이 연구는 cRBC 코호트에 라벨을 붙이는 것을 포함합니다: 투여 후, 이 cRBC 코호트는 순환하는 혈액에서 노화되고 "수명"이 끝나면 사라집니다. 결과는 다음과 같은 방식으로 해석됩니다.

   - 처음 3개의 혈액 샘플의 방사능이 일정하게 유지되는 경우(부패 보정 후), 이는 조기 세포 파괴가 없다는 증거로 간주됩니다.

   다음 3개의 샘플은 추후에 추출될 예정입니다[30일 이내, 그 이후에는 크롬 51의 붕괴로 인해 더 이상 샘플의 방사능 측정이 불가능하고 세포에서 1.2%의 비율로 크롬이 제거됨] 매우 낮은 활동에 대한 방사능 수치의 정확성 부족]. 하나는 cRBC의 수명이 33일 이상이라는 결론을 내릴 것입니다.

   - 처음 3개의 샘플에서 방사능이 유의미한 방식으로 감소하고 참조 곡선보다 일찍 감소하는 경우, 서로 가까이에서 채취한 다른 3개의 샘플을 통해 cRBC의 평균 수명을 추정할 수 있습니다.

3. 실험 계획

   3.1 연구 유형 임상 타당성 분석.

   3.2 실험 계획

   이 연구는 4단계로 수행됩니다.

   1. 건강한 자비로운 기증자로부터 얻은 HSC 이식편에서 분리한 단핵 세포로부터 혈액 1mL에 해당하는 체외 생산, 즉 5x109 적출된 RBC,
   2. 적혈구의 수명을 연구하는 데 사용되는 고전적인 프로토콜에 따라 51Cr로 이러한 cRBC를 라벨링합니다.
   3. 자가 cRBC를 동일한 기증자에게 재주입,
   4. 주입된 세포의 반감기를 측정하기 위해 최대 33일 동안 수신기를 추적합니다.
4. 수혜자의 특성 4.1 연구 모집단에 대한 설명 환자가 아닌 건강한 지원자를 대상으로 연구를 수행하는 선택은 용혈로 이어질 수 있는 상황을 피하는 건강한 생리학적 맥락을 가질 필요성에 근거합니다. 프로토콜은 성장 인자를 사용한 동원을 요구하므로 말초 줄기 세포(PSC) 기증자는 G-CSF를 받습니다.

건강한 기증자가 G-CSF에 불필요하게 노출되는 것을 피하기 위해 PSC의 가족 내 기증자 중에서 자발적 수령자를 모집합니다.

HSC 동원과 관련하여 그들은 5일 동안 체중 1kg당 10µg의 G-CSF를 피하 주사로 받게 됩니다.

4.1.1 세포분리반출법에 의한 단핵 세포의 수집

출발 물질의 특성:

말초 혈액 조혈 줄기 세포는 환자에게 이식할 이식편이 > 7x106 CD34+ 세포/환자 수용자의 체중 kg을 포함하고 문헌에서 조혈을 재구성하기에 충분한 것으로 확립된 세포 용량을 포함하지 않는 한 배양된 RBC 생산을 위해 사용되지 않습니다. 동종 이식편을 받는 환자의 모습. 따라서 연구 프로토콜은 환자에게 기회를 잃지 않을 것입니다.

4.1.2 프로토콜을 위한 CD34+ 세포 분리 연구에 사용할 CD34+ 세포는 Isolex® 시스템을 사용하여 양성 면역자기 선별 컬럼에서 선택됩니다. 시스템이 제대로 작동하려면 최소 45x106 CD34+ 셀이 필요합니다. 이러한 제한 요인으로 인해 G-CSF로 동원된 줄기 세포를 출발 물질로 사용해야 합니다. 연구를 위해 이 샘플을 제거한 후 이식편은 최소 7x106 CD34+ 세포/kg 환자 체중을 포함해야 합니다.

선택 후 시작 물질은 면역자기 선택에 의해 정제된 임상 등급 CD34+ 세포로 구성됩니다. 50% 이상의 CD34+ 세포의 순도는 면역자기 선택 후에 얻어져야 합니다. 살아있는 세포의 백분율은 트리판 블루로 염색하여 결정됩니다. 정제된 CD34+ 세포는 10% DMSO가 포함된 4% 알부민 용액에서 동결되고 1x106 CD34+ 세포가 포함된 2.5mL 저온 튜브에서 조절됩니다. 해동 후 세포 생존율은 50% 이상이어야 합니다.

0일째 배양에 접종하려면 최소 1백만 개의 생존 가능한 CD34+ 세포가 필요합니다.

4.1.3 cRBC의 생물학적 특성

활성 원리는 필터링된 cRBC와 51Cr로 라벨링된 최종 제품 cRBC입니다. 라벨 부착 직후 제품을 재주입해야 하므로 활성 성분에 대해 특성 분석을 수행하고 다음 요소를 포함합니다.

활성 원리는 다음으로 구성되어야 합니다.

1. 다음을 특징으로 하는 RBC:

   • 그들의 형태(May-Grunwald-Giemsa로 염색된 슬라이드에서),
   • 그들의 헤모글로빈 함량(Sysmex XE-2100 자동화에서 측정된 MHC > 25 pg)(3.2.S.4.3 참조);
2. 호산성 적혈구 < 1.2%(슬라이드에서 > 10,000개 세포에서);
3. 슬라이드에서 계산된 10,000개 이상의 세포에서 다른 모든 세포 유형을 제외합니다.

4.1.4 유효 성분의 충분한 기준(cRBC)

제품에 다음과 같은 특성이 있는 경우 크롬 라벨이 표시됩니다.

• 5~10x109 RBC, MHC > 25 pg,
• < 1.2% 호산성 적혈구,
• 백혈구의 부재. 나머지 미생물 제어는 사후에 알려질 것입니다.

4.1.5 크롬 51로 라벨링

이 단계는 핵의학 클리닉에서 수행됩니다. 라벨링이 수행됩니다.

• cRBC 현탁액을 사용하여
• 및 교정 시 활성이 37 MBq/mL인 [51Cr] 크롬산나트륨의 멸균 용액.

라벨링 절차 자체는 임상적으로 무균 상태에서 수행됩니다. 현탁액은 마개로 닫힌 2mL 주사기를 사용하여 0.3mL 분획(주입 전 주사기의 51Cr 활성 측정과 연결된 제약 조건)으로 주입됩니다. 재주입되는 최대 용량은 정맥 경로로 5mL입니다.

4.1.6 51Cr로 표시된 최종 제품의 충분한 기준

라벨이 부착된 제품은 다음과 같은 특성을 나타내는 경우 건강한 지원자에게 주사됩니다.

• 2,500KBq(최소)에서 5,000KBq(최대) 사이의 51Cr 활동,
• 세포에 결합되지 않은 51Cr의 부재.

4.1.7 리시버에 주입 이 단계는 줄기 세포 수집 후 2개월 이내에 이루어집니다. 규제상의 이유로 핵의학 클리닉에 위치하고 준비 실험실에 인접한 방사성 약물 투여를 위해 예약된 방에서 표지된 cRBC를 1mL 용량으로 직접 정맥 주사합니다.

감시 기간이 끝날 때까지 정맥 경로 유지. 주사 후 T+1시간 및 T+3시간에 팔꿈치 굴곡부에서 정맥 천자에 의해 EDTA에 혈액 10mL 샘플 2개 수집.

퇴원 기준 : 발열 또는 떨림 없음, 정상 혈압 및 정상적인 임상 검사.

주사 후 감시의 총 지속 시간: 4시간.

4.2 cRBC의 수명 측정을 위한 예약 계획 팔꿈치 굽힘 부위의 정맥 천자에 의한 10mL 샘플 수집 및 수신자의 후속 조치는 CIC St Antoine에서 수행됩니다.

튜브를 핵의학 클리닉으로 옮김.

• 세 번째 샘플은 주입 후 T+24시간 동안 채취됩니다.
• 다음 3일은 첫 번째 샘플에서 추정된 감퇴에 따라 선택한 날(주사 후 T+48h에서 T+30일 사이)에 촬영됩니다.

고정된 샘플링 날짜 설정의 부족은 현재 알려지지 않은 이 동종 cRBC 집단의 동역학에 적응해야 할 필요성에 의해 정당화됩니다.

진료 예약 시마다 임상 검사를 실시합니다. 측정을 수행한 후 샘플은 폐기됩니다.

결론적으로 이 접근 방식에는 몇 가지 장점이 있습니다.

1. 그것은 연구의 유일한 목적을 위해 건강한 지원자에게 성장 인자인 G-CSF를 주입하는 것을 피합니다.
2. 자가 상황은 면역학적 위험과 감염원 전파 위험을 방지합니다.
3. 51Cr은 에너지 320keV의 감마선 방사체이며 방사성 기간은 27.7일입니다. 이 연구로 인한 방사선 조사는 측정 가능한 위험이 없습니다. 수신기 또는 그와 접촉하는 사람들을 위해 특별한 방사선 보호 예방 조치를 구상할 필요가 없습니다.