培养的红细胞：体内研究的寿命 (GRc2008)

1. 一般性

   1.1 cRBC 的临床级生产 在本研究中，cRBC 既是活性成分又是经过放射性铬标记的最终产品。

   要重新注射的 5x109 cRBC 的数量取决于放射性数量在 2500 和 5000 kBq 之间的必要性，以便具有足够的灵敏度来测量寿命。

   1.2 假设检验 由于 cRBC 在体外具有天然 RBC 的所有功能特征，因此假设它们在体内是有活力的。

   这种生存能力将通过测量它们的寿命来评估。 它将与报告的天然 RBC 寿命（即 30+3 天）进行比较。

2. 研究目的

   2.1 培养红细胞体内寿命的主要目的研究。

   2.2 评价标准

   2.2.1 主要标准：主要标准是 cRBC 的测量寿命。 它将与报告的天然 RBC 寿命（即 30+3 天）进行比较。

   该研究涉及标记一组 cRBC：给药后，这组 cRBC 将在循环血液中老化，然后在其“寿命”结束时消失。 结果将按以下方式解释：

   - 如果前 3 份血样的放射性保持不变（在校正衰变后），这将被视为支持不存在过早细胞破坏的证据。

   稍后将抽取以下 3 个样本 [在 30 天的期限内，之后由于铬 51 的衰变，将无法再测量样本的放射性，铬以 1.2% 的速度从细胞中消除每天和非常低活动的放射性计数缺乏精确度]。 人们会得出结论，cRBC 的寿命超过 33 天。

   - 如果在前 3 个样本中，放射性以显着方式减少并且比参考曲线更早减少，则另外三个靠近在一起的样本将能够估计 cRBC 的平均寿命。

3. 实验计划

   3.1 研究类型 临床可行性分析。

   3.2 实验方案

   研究将分4个阶段进行：

   1. 从从健康慈善捐献者的 HSC 移植物中分离出的单核细胞，在体外产生相当于 1mL 的血液，即 5x109 去核红细胞，
   2. 根据用于研究红细胞寿命的经典方案，用 51Cr 标记这些 cRBC，
   3. 将自体 cRBC 重新注入同一供体，
   4. 接受者的最长持续时间为 33 天的随访，以测量注射细胞的半衰期。
4. 接受者的特征 4.1 研究人群的描述 选择在健康志愿者而不是患者中进行研究是基于健康生理环境的必要性，避免任何可能导致溶血的情况。 由于该协议需要使用生长因子进行动员，因此外周干细胞 (PSC) 的捐赠者接受 G-CSF。

自愿接受者将在 PSC 的家庭内捐赠者中招募，以避免健康捐赠者不必要地暴露于 G-CSF。

在动员 HSC 的情况下，他们将接受为期 5 天的 G-CSF 皮下注射，剂量为 10 µg/kg 体重。

4.1.1 通过细胞单采术收集单核细胞

起始材料的特性：

外周血造血干细胞不会被用于培养红细胞的生产，除非用于患者的移植物含有 > 7x106 CD34+ 细胞/kg 患者接受者体重，文献中确定的细胞剂量足以重建造血功能接受同种异体移植物的患者。 因此，研究方案不会给患者带来机会损失。

4.1.2 为协议分离 CD34+ 细胞 将使用 Isolex® 系统在阳性免疫磁性选择柱上选择用于研究的 CD34+ 细胞。 至少需要 45x106 个 CD34+ 细胞才能使系统正常运行。 这些限制因素迫使我们使用用 G-CSF 动员的干细胞作为起始材料。 为研究取出该样本后，移植物必须至少包含 7x106 CD34+ 细胞/kg 患者体重。

选择后起始材料将由通过免疫磁性选择纯化的临床级 CD34+ 细胞组成。 免疫磁选后应获得纯度超过 50% 的 CD34+ 细胞。 活细胞的百分比将通过用台盼蓝染色来确定。 纯化的 CD34+ 细胞将冷冻在含有 10% DMSO 的 4% 白蛋白溶液中，并在含有 1x106 个 CD34+ 细胞的 2.5 mL 冷冻管中进行调节。 解冻后，细胞活力应在50%以上。

在第 0 天进行培养时，至少需要 100 万个活的 CD34+ 细胞。

4.1.3 cRBC 的生物学特性

活性成分是过滤的 cRBC，最终产物 cRBC 标记有 51Cr。 由于产品应在标记后立即重新注射，因此将根据活性成分进行表征，并将涉及以下要素：

活性成分应包括：

1. 红细胞的特点是：

   • 它们的形态（在用 May-Grunwald-Giemsa 染色的载玻片上），
   • 它们的血红蛋白含量（MHC > 25 pg，在 Sysmex XE-2100 自动检测仪中测量）（参见 3.2.S.4.3）；
2. 嗜酸成红细胞 < 1.2%（载玻片上计数的 > 10,000 个细胞）；
3. 排除幻灯片上计数的 > 10,000 个细胞中的所有其他细胞类型。

4.1.4 活性成分 (cRBC) 的充分标准

如果产品具有以下特征，将被标记为铬：

• 5 至 10x109 RBC，MHC > 25 pg，
• < 1.2% 嗜酸成红细胞，
• 没有白细胞。 其余的微生物控制将在事后得知。

4.1.5 用铬 51 标记

此步骤将在核医学诊所进行。 进行标记：

• 使用 cRBC 悬浮液，
• 和 [51Cr] 铬酸钠的无菌溶液，校准时活性为 37 MBq/mL。

标记过程本身是在临床无菌条件下进行的。 使用带塞子的 2 mL 注射器以 0.3 mL 的分数（与注射前注射器 51Cr 活性的测量相关的约束）注射悬浮液。 通过静脉途径再注射的最大体积为 5 mL。

4.1.6 标有 51Cr 的最终产品的充分标准

贴有标签的产品如果具有以下特征，将被注射到健康志愿者体内：

• 51Cr 活性在 2,500 KBq（最小值）和 5,000 KBq（最大值）之间，
• 不与细胞结合的 51Cr 缺失。

4.1.7 注射到受体中 这一步将在干细胞采集后 2 个月内进行。 出于监管原因，在位于核医学诊所并毗邻准备实验室的用于管理放射性药物的房间内，直接静脉注射 1 mL 标记的 cRBC。

维持静脉通路直至监测期结束。 在注射后 T+1 小时和 T+3 小时，通过肘部弯曲处的静脉穿刺将 2 份 10 mL 血液样本收集到 EDTA 中。

出院标准：无发热或寒战，血压正常，临床检查正常。

注射后监测的总持续时间：4小时。

4.2 测量 cRBC 寿命的预约计划 在 CIC St Antoine 通过肘部弯曲处的静脉穿刺收集 10 mL 样本，并对接受者进行随访。

将试管转移到核医学诊所。

• 第三个样品将在注射后 T+24 小时采集。
• 以下 3 将在根据第一个样本估计的衰减选择的日期（注射后 T+48h 和 T+30 天之间）进行。

由于需要适应目前未知的 cRBC 同质种群的动力学，因此无法确定固定采样日期。

每次预约都会进行临床检查。 进行测量后，样品将被销毁。

总之，这种方法有几个优点：

1. 它避免了为了研究的唯一目的而将生长因子 G-CSF 注射到健康志愿者体内。
2. 自体情况避免了任何免疫风险和任何传染性病原体传播的风险。
3. 51Cr 是能量为 320 keV 的伽马辐射发射体，放射性周期为 27.7 天。 本研究产生的辐射不涉及可测量的风险。 不需要为接收者或与他接触的人设想特别的辐射防护预防措施。