Kultivierte rote Blutkörperchen: Lebensdauer in Vivo-Studie (GRc2008)

1. ALLGEMEINES

   1.1 Produktion von cRBC in klinischer Qualität In dieser Studie ist das cRBC sowohl der Wirkstoff als auch das Endprodukt, das einer Markierung mit radioaktivem Chrom unterzogen wird.

   Die zu reinjizierende Menge an 5x109 cRBC wird durch die Notwendigkeit bestimmt, eine Radioaktivitätsmenge zwischen 2500 und 5000 kBq zu haben, um eine ausreichende Empfindlichkeit zur Messung der Lebensdauer zu haben.

   1.2 Getestete Hypothese Da die cRBC in vitro alle funktionellen Eigenschaften von nativen RBC aufweisen, wird die Hypothese aufgestellt, dass sie in vivo lebensfähig sein werden.

   Diese Lebensfähigkeit wird durch Messung ihrer Lebensdauer bewertet. Sie wird mit der angegebenen Lebensdauer von nativen Erythrozyten verglichen, d. h. 30 + 3 Tage.

2. ZIELE DER STUDIE

   2.1 Hauptziel Untersuchung der Lebensdauer von kultivierten roten Blutkörperchen in vivo.

   2.2 Bewertungskriterien

   2.2.1 Prinzip: Das Hauptkriterium ist die gemessene Lebensdauer der EK. Sie wird mit der angegebenen Lebensdauer von nativen Erythrozyten verglichen, d. h. 30 + 3 Tage.

   Die Studie beinhaltet die Kennzeichnung einer Kohorte von cRBC: Nach der Verabreichung wird diese Kohorte von cRBC im zirkulierenden Blut altern und dann am Ende ihrer "Lebensspanne" verschwinden. Die Ergebnisse werden wie folgt interpretiert:

   - Bleibt die Radioaktivität der ersten 3 Blutproben (nach Zerfallskorrektur) konstant, wird dies als Beweis für das Ausbleiben einer vorzeitigen Zellzerstörung gewertet.

   Die folgenden 3 Proben werden später gezogen [innerhalb der Frist von 30 Tagen, danach ist die Messung der Radioaktivität der Proben aufgrund des Zerfalls von Chrom 51 nicht mehr möglich, Eliminierung von Chrom aus den Zellen mit einer Rate von 1,2% pro Tag und Ungenauigkeit der radioaktiven Zählung bei sehr geringen Aktivitäten]. Man wird daraus schließen, dass die Lebensdauer des cRBC 33 Tage übersteigt.

   - Wenn die Radioaktivität in den ersten 3 Proben deutlich und früher als in den Referenzkurven abnimmt, ermöglichen drei weitere Proben, die nahe beieinander genommen werden, eine Schätzung der mittleren Lebensdauer der EK.

3. EXPERIMENTELLER PLAN

   3.1 Art der Studie Klinischer Durchführbarkeitstest.

   3.2 Versuchsplan

   Die Studie wird in 4 Phasen durchgeführt:

   1. Produktion in vitro des Äquivalents von 1 ml Blut, d. h. 5 x 109 enukleierte Erythrozyten, aus mononukleären Zellen, die aus einem HSC-Transplantat isoliert wurden, das von einem gesunden wohlwollenden Spender erhalten wurde,
   2. Markierung dieser cRBC mit 51Cr gemäß dem klassischen Protokoll zur Untersuchung der Lebensdauer roter Blutkörperchen,
   3. Reinjektion des autologen cRBC in denselben Spender,
   4. Follow-up des Empfängers für eine maximale Dauer von 33 Tagen, um die Halbwertszeit der injizierten Zellen zu messen.
4. EIGENSCHAFTEN DER EMPFÄNGER 4.1 Beschreibung der Studienpopulation Die Entscheidung, die Studie an gesunden Probanden und nicht an Patienten durchzuführen, basiert auf der Notwendigkeit, einen gesunden physiologischen Kontext zu haben, um jede Situation zu vermeiden, die zu einer Hämolyse führen könnte. Da das Protokoll die Mobilisierung mit einem Wachstumsfaktor erfordert, erhalten die Spender von peripheren Stammzellen (PSC) G-CSF.

Die freiwilligen Empfänger werden unter innerfamiliären PSC-Spendern rekrutiert, um die unnötige Exposition eines gesunden Spenders gegenüber G-CSF zu vermeiden.

Im Rahmen der Mobilisierung von HSC erhalten sie für 5 Tage subkutane Injektionen von G-CSF in einer Dosis von 10 µg/kg Körpergewicht.

4.1.1 Sammlung mononukleärer Zellen durch Cytapherese

Eigenschaften des Ausgangsmaterials:

Hämatopoetische Stammzellen aus peripherem Blut werden nicht für die Produktion von kultivierten Erythrozyten entnommen, es sei denn, das für den Patienten bestimmte Transplantat enthält > 7 x 106 CD34+-Zellen/kg Körpergewicht des Empfängers des Patienten, wobei die Zelldosis in der Literatur als ausreichend zur Wiederherstellung der Hämatopoese festgestellt wurde eines Patienten, der ein allogenes Transplantat erhält. Somit geht für den Patienten durch das Forschungsprotokoll keine Chance verloren.

4.1.2 Isolierung von CD34+-Zellen für das Protokoll Die für die Forschung zu verwendenden CD34+-Zellen werden auf einer positiven immunomagnetischen Selektionssäule unter Verwendung eines Isolex®-Systems selektiert. Für eine gute Funktion des Systems sind mindestens 45x106 CD34+ Zellen erforderlich. Diese limitierenden Faktoren zwingen uns dazu, mit G-CSF mobilisierte Stammzellen als Ausgangsmaterial zu verwenden. Nach Entnahme dieser Probe für die Studie muss das Transplantat mindestens 7 x 106 CD34+-Zellen/kg Körpergewicht des Patienten enthalten.

Das Ausgangsmaterial nach der Selektion wird aus CD34+-Zellen klinischer Qualität bestehen, die durch immunmagnetische Selektion gereinigt wurden. Nach immunmagnetischer Selektion sollte eine Reinheit von mehr als 50 % CD34+-Zellen erreicht werden. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen wird durch Färben mit Trypanblau bestimmt. Die gereinigten CD34+-Zellen werden in einer 4%igen Albuminlösung mit 10% DMSO eingefroren und in 2,5-ml-Kryoröhrchen mit 1x106 CD34+-Zellen konditioniert. Nach dem Auftauen sollte die Zellviabilität mehr als 50 % betragen.

Für die Aussaat in Kultur am Tag 0 sind mindestens 1 Million lebensfähige CD34+-Zellen erforderlich.

4.1.3 Biologische Charakterisierung des cRBC

Das aktive Prinzip ist filtriertes cRBC und das Endprodukt cRBC ist mit 51 Cr markiert. Da das Produkt unmittelbar nach der Kennzeichnung erneut injiziert werden sollte, erfolgt die Charakterisierung anhand des Wirkstoffs und umfasst die folgenden Elemente:

Das Wirkprinzip sollte bestehen aus:

1. Erythrozyten gekennzeichnet durch:

   • ihre Morphologie (auf mit May-Grunwald-Giemsa gefärbten Objektträgern),
   • ihren Hämoglobingehalt (MHC > 25 pg, gemessen in einem Sysmex XE-2100-Automaten) (siehe 3.2.S.4.3);
2. azidophile Erythroblasten < 1,2 % (in > 10.000 auf einem Objektträger gezählten Zellen);
3. unter Ausschluss aller anderen Zelltypen in > 10.000 auf einem Objektträger gezählten Zellen.

4.1.4 Ausreichende Kriterien des Wirkstoffs (cRBC)

Das Produkt wird mit Chrom gekennzeichnet, wenn es folgende Eigenschaften aufweist:

• 5 bis 10 x 109 Erythrozyten mit MHC > 25 pg,
• < 1,2 % acidophile Erythroblasten,
• ein Fehlen von Leukozyten. Die verbleibenden mikrobiologischen Kontrollen sind a posteriori bekannt.

4.1.5 Kennzeichnung mit Chrom 51

Dieser Schritt wird in der Klinik für Nuklearmedizin durchgeführt. Die Kennzeichnung erfolgt:

• unter Verwendung einer Suspension von cRBC,
• und eine sterile Lösung von [51Cr]-Natriumchromat mit einer Aktivität von 37 MBq/mL bei der Kalibrierung.

Das Markierungsverfahren selbst wird unter klinisch sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Suspension wird mit 2-ml-Spritzen, die mit einem Stopfen verschlossen sind, in 0,3-ml-Fraktionen injiziert (Einschränkung in Verbindung mit der Messung der 51Cr-Aktivität der Spritzen vor der Injektion). Das maximale wiederinjizierte Volumen beträgt 5 ml auf intravenösem Weg.

4.1.6 Ausreichende Kriterien des mit 51Cr gekennzeichneten Endprodukts

Das gekennzeichnete Produkt wird dem gesunden Freiwilligen injiziert, wenn es die folgenden Merkmale aufweist:

• 51Cr-Aktivität zwischen 2.500 KBq (Minimum) und 5.000 KBq (Maximum),
• ein Fehlen von 51 Cr, das nicht an Zellen gebunden ist.

4.1.7 Injektion in Empfänger Dieser Schritt findet innerhalb von 2 Monaten nach der Stammzellenentnahme statt. Direkte intravenöse Injektion von markierten EK in einem Volumen von 1 ml in einem Raum, der für die Verabreichung radioaktiver Arzneimittel reserviert ist und sich aus regulatorischen Gründen in der nuklearmedizinischen Klinik und neben dem Vorbereitungslabor befindet.

Aufrechterhaltung eines venösen Zugangs bis zum Ende des Überwachungszeitraums. Entnahme von 2 Proben von 10 ml Blut in EDTA durch venöse Punktion an der Ellenbogenbeuge, bei T+1h und T+3h nach der Injektion.

Kriterien für die Entlassung aus der Klinik: kein Fieber oder Schüttelfrost, normaler Blutdruck und normale klinische Untersuchung.

Gesamtdauer der Nachinjektionsüberwachung: 4 Stunden.

4.2 Planung der Termine für die Messung der Lebensdauer von cRBC Die Entnahme von 10-ml-Proben durch venöse Punktion an der Ellenbogenbeuge und die Nachsorge der Empfänger werden im CIC St. Antoine durchgeführt.

Überführung der Schläuche in die nuklearmedizinische Klinik.

• Die dritte Probe wird T+24h nach der Injektion entnommen.
• Die folgenden 3 werden an Tagen entnommen, die gemäß dem anhand der ersten Proben geschätzten Zerfall gewählt werden (zwischen T+48 h und T+30 Tagen nach der Injektion).

Das Fehlen fester Probenahmetermine ist durch die Notwendigkeit gerechtfertigt, sich an die Kinetik dieser homogenen, derzeit unbekannten Population von cRBC anzupassen.

Bei jedem Termin wird eine klinische Untersuchung durchgeführt. Nach Durchführung der Messungen werden die Proben vernichtet.

Zusammenfassend hat dieser Ansatz mehrere Vorteile:

1. Es vermeidet die Injektion eines Wachstumsfaktors, G-CSF, in einen gesunden Freiwilligen für die alleinigen Ziele der Studie.
2. Die autologe Situation vermeidet jedes immunologische Risiko und jedes Risiko der Übertragung von Infektionserregern.
3. 51Cr ist ein Emittent von Gammastrahlung mit einer Energie von 320 keV und hat eine radioaktive Periode von 27,7 Tagen. Die aus dieser Studie resultierende Bestrahlung beinhaltet kein messbares Risiko. Es müssen keine besonderen Strahlenschutzmaßnahmen getroffen werden, weder für den Empfänger noch für diejenigen, die mit ihm in Kontakt kommen.