Dyrkede røde blodceller: Levetid in vivo-studie (GRc2008)

1. GENERELT

   1.1 Klinisk produksjon av cRBC I denne studien er cRBC både det aktive prinsippet og sluttproduktet som er utsatt for radioaktiv krommerking.

   Mengden 5x109 cRBC som skal reinjiseres bestemmes av nødvendigheten av å ha en mengde radioaktivitet som ligger mellom 2500 og 5000 kBq for å ha tilstrekkelig følsomhet til å måle levetiden.

   1.2 Hypotese testet Siden cRBC har in vitro alle funksjonelle egenskaper til naturlig RBC, er det antatt at de vil være levedyktige in vivo.

   Denne levedyktigheten vil bli evaluert ved å måle levetiden deres. Den vil bli sammenlignet med den rapporterte levetiden til naturlig RBC, dvs. 30+3 dager.

2. MÅL FOR STUDIEN

   2.1 Hovedmål Studie av levetiden in vivo til dyrkede røde blodceller.

   2.2 Evalueringskriterier

   2.2.1 Principal: Hovedkriteriet er den målte levetiden til cRBC. Den vil bli sammenlignet med den rapporterte levetiden til naturlig RBC, dvs. 30+3 dager.

   Studien innebærer merking av en kohort av cRBC: etter administrering vil denne gruppen av cRBC eldes i det sirkulerende blodet og deretter forsvinne ved slutten av sin "levetid". Resultatene vil bli tolket på følgende måte:

   - hvis radioaktiviteten til de første 3 blodprøvene forblir konstant (etter korrigering for forfall), vil dette bli tatt som bevis til fordel for fravær av for tidlig celleødeleggelse.

   Følgende 3 prøver vil bli tatt senere [innenfor grensen på 30 dager, hvoretter måling av radioaktiviteten til prøvene ikke lenger vil være mulig på grunn av nedbrytning av krom 51, eliminering av krom fra cellene med en hastighet på 1,2 % per dag og mangel på presisjon av radioaktivt antall for svært lave aktiviteter]. Man vil konkludere med at levetiden til cRBC er over 33 dager.

   - hvis radioaktiviteten i de første 3 prøvene avtar betydelig og tidligere enn på referansekurvene, vil tre andre prøver tatt tett sammen muliggjøre estimering av gjennomsnittlig levetid for cRBC.

3. EKSPERIMENTELL PLAN

   3.1 Type studie Klinisk gjennomførbarhetsanalyse.

   3.2 Forsøksplan

   Studien vil bli gjennomført i 4 faser:

   1. produksjon in vitro av ekvivalenten til 1 ml blod, dvs. 5x109 enukleert RBC, fra mononukleære celler isolert fra et HSC-transplantat hentet fra en sunn velvillig donor,
   2. merking av disse cRBC med 51Cr, i henhold til den klassiske protokollen som brukes til å studere levetiden til røde blodceller,
   3. reinjeksjon av den autologe cRBC i samme donor,
   4. oppfølging av mottakeren i maksimalt 33 dager for å måle halveringstiden til de injiserte cellene.
4. KARAKTERISTIKKER AV MOTTAKERNE 4.1 Beskrivelse av studiepopulasjonen Valget av å gjennomføre studien på friske frivillige og ikke på pasienter er basert på nødvendigheten av å ha en sunn fysiologisk kontekst for å unngå enhver situasjon som kan føre til hemolyse. Siden protokollen krever mobilisering med en vekstfaktor, mottar giverne av perifere stamceller (PSC) G-CSF.

De frivillige mottakerne vil bli rekruttert blant intra-familiære givere av PSC, for å unngå unødvendig eksponering av en frisk giver for G-CSF.

I forbindelse med mobilisering av HSC vil de i 5 dager motta subkutane injeksjoner av G-CSF i en dose på 10 µg/kg kroppsvekt.

4.1.1 Innsamling av mononukleære celler ved cytaferese

Kjennetegn ved utgangsmaterialet:

Hematopoietiske stamceller fra perifert blod vil ikke bli tatt for produksjon av dyrket RBC med mindre transplantatet som er bestemt for pasienten inneholder > 7x106 CD34+-celler/kg kroppsvekt av pasientmottakeren, celledosen etablert i litteraturen som tilstrekkelig til å rekonstituere hematopoiesen av en pasient som mottar et allogent transplantat. Forskningsprotokollen vil derfor ikke medføre noe tap av sjanser for pasienten.

4.1.2 Isolering av CD34+-celler for protokollen CD34+-cellene som skal brukes til forskning vil bli valgt på en positiv immunomagnetisk seleksjonskolonne ved bruk av et Isolex®-system. Minimum 45x106 CD34+-celler er nødvendig for at systemet skal fungere godt. Disse begrensende faktorene forplikter oss til å bruke stamceller mobilisert med G-CSF som utgangsmateriale. Etter fjerning av denne prøven for studien, må transplantatet inneholde minimum 7x106 CD34+-celler/kg kroppsvekt til pasienten.

Utgangsmaterialet etter seleksjon vil bestå av CD34+-celler av klinisk kvalitet renset ved immunomagnetisk seleksjon. En renhet på mer enn 50 % CD34+-celler bør oppnås etter immunomagnetisk seleksjon. Prosentandelen av levedyktige celler vil bli bestemt ved farging med trypanblått. De rensede CD34+-cellene vil bli frosset i en 4 % albuminløsning inneholdende 10 % DMSO og kondisjonert i 2,5 mL kryorør som inneholder 1x106 CD34+-celler. Etter tining bør cellelevedyktigheten være mer enn 50 %.

Minst 1 million levedyktige CD34+-celler er nødvendig for såing i kultur på dag 0.

4.1.3 Biologisk karakterisering av cRBC

Det aktive prinsippet er filtrert cRBC og sluttproduktet cRBC merket med 51Cr. Siden produktet skal injiseres på nytt umiddelbart etter merking, vil karakteriseringen utføres på det aktive prinsippet og vil omfatte følgende elementer:

Det aktive prinsippet bør bestå av:

1. RBC preget av:

   • deres morfologi (på lysbilder farget med May-Grunwald-Giemsa),
   • deres hemoglobininnhold (MHC > 25 pg målt i en Sysmex XE-2100 automat) (se 3.2.S.4.3);
2. acidofile erytroblaster < 1,2 % (i > 10 000 celler telt på et objektglass);
3. til ekskludering av alle andre celletyper i > 10 000 celler telt på et lysbilde.

4.1.4 Tilstrekkelige kriterier for det aktive prinsippet (cRBC)

Produktet vil bli merket med krom hvis det har følgende egenskaper:

• 5 til 10x109 RBC med MHC > 25 pg,
• < 1,2 % acidofile erytroblaster,
• fravær av leukocytter. De resterende mikrobiologiske kontrollene vil bli kjent i etterkant.

4.1.5 Merking med krom 51

Dette trinnet vil bli utført i nukleærmedisinsk klinikk. Merking utføres:

• ved å bruke en suspensjon av cRBC,
• og en steril løsning av [51Cr] natriumkromat med en aktivitet på 37 MBq/ml ved kalibrering.

Selve merkeprosedyren utføres under klinisk sterile forhold. Suspensjonen injiseres i 0,3 mL fraksjoner (begrensning knyttet til måling av 51Cr-aktiviteten til sprøytene før injeksjon) ved bruk av 2 mL sprøyter lukket med en propp. Maksimalt volum som reinjiseres vil være 5 ml intravenøst.

4.1.6 Tilstrekkelige kriterier for sluttproduktet merket med 51Cr

Det merkede produktet vil bli injisert i den friske frivillige hvis det har følgende egenskaper:

• 51Cr-aktivitet mellom 2500 KBq (minimum) og 5000 KBq (maksimum),
• et fravær av 51Cr ikke bundet til celler.

4.1.7 Injeksjon i mottakere Dette trinnet vil finne sted innen 2 måneder etter stamcelleinnsamling. Direkte intravenøs injeksjon av merket cRBC i et volum på 1 mL, i et rom reservert for administrering av radioaktive legemidler, plassert i nukleærmedisinsk klinikk og ved siden av preparatlaboratoriet, av regulatoriske årsaker.

Vedlikehold av en venøs rute til slutten av overvåkingsperioden. Innsamling av 2 prøver på 10 mL blod i EDTA ved venøs punktering ved bøyning av albuen, ved T+1t og T+3t etter injeksjon.

Kriterier for utskrivning fra klinikken: fravær av feber eller skjelving, normalt blodtrykk og normal klinisk undersøkelse.

Total varighet av overvåking etter injeksjon: 4 timer.

4.2 Planlegging av avtaler for måling av levetiden til cRBC Innsamling av 10 mL prøver ved venøs punktering ved bøyning av albuen og oppfølging av mottakerne vil bli utført ved CIC St Antoine.

Overføring av rørene til nukleærmedisinsk klinikk.

• Den tredje prøven tas T+24 timer etter injeksjon.
• De følgende 3 vil bli tatt på dager valgt i henhold til forfallet beregnet fra de første prøvene (mellom T+48t og T+30 dager etter injeksjon).

Mangelen på etablering av faste datoer for prøvetaking er begrunnet med nødvendigheten av å tilpasse seg kinetikken til denne homogene populasjonen av cRBC, foreløpig ukjent.

En klinisk undersøkelse vil bli utført ved hver time. Etter å ha utført målingene vil prøvene bli destruert.

Avslutningsvis har denne tilnærmingen flere fordeler:

1. Den unngår å injisere en vekstfaktor, G-CSF, i en frisk frivillig for de eneste formålene med studien.
2. Den autologe situasjonen unngår enhver immunologisk risiko og enhver risiko for overføring av smittestoffer.
3. 51Cr er en emitter av gammastråling med energi 320 keV og har en radioaktiv periode på 27,7 dager. Bestrålingen som følge av denne studien innebærer ingen målbar risiko. Ingen spesielle strålebeskyttende forholdsregler trenger å tenkes, verken for mottakeren eller for de som er i kontakt med ham.