Cultivo de glóbulos vermelhos: estudo do tempo de vida in vivo (GRc2008)

1. GENERALIDADES

   1.1 Produção de cRBC de grau clínico Neste estudo, o cRBC é o princípio ativo e o produto final submetido à marcação com cromo radioativo.

   A quantidade de 5x109 cRBC a ser reinjetada é determinada pela necessidade de ter uma quantidade de radioatividade entre 2500 e 5000 kBq para ter sensibilidade suficiente para medir o tempo de vida.

   1.2 Hipótese testada Uma vez que os cRBC apresentam in vitro todas as características funcionais dos eritrócitos nativos, hipotetiza-se que serão viáveis ​​in vivo.

   Essa viabilidade será avaliada medindo-se sua vida útil. Será comparado com o tempo de vida relatado de RBC nativo, ou seja, 30+3 dias.

2. OBJETIVOS DO ESTUDO

   2.1 Objetivo principal Estudo do tempo de vida in vivo de glóbulos vermelhos cultivados.

   2.2 Critérios de avaliação

   2.2.1 Principal: O critério principal é o tempo de vida medido do cRBC. Será comparado com o tempo de vida relatado de RBC nativo, ou seja, 30+3 dias.

   O estudo envolve rotular uma coorte de cRBC: após a administração, essa coorte de cRBC envelhecerá no sangue circulante e depois desaparecerá no final de seu "período de vida". Os resultados serão interpretados da seguinte maneira:

   - se a radioatividade das 3 primeiras amostras de sangue permanecer constante (após a correção da deterioração), isso será considerado evidência a favor da ausência de destruição celular prematura.

   As 3 amostras seguintes serão colhidas posteriormente [no limite de 30 dias, após o que não será mais possível medir a radioactividade das amostras devido ao decaimento do crómio 51, eliminação do crómio das células à taxa de 1,2% por dia e falta de precisão da contagem radioativa para atividades muito baixas]. Pode-se concluir que o tempo de vida do cRBc é superior a 33 dias.

   - se, nas 3 primeiras amostras, a radioatividade diminuir significativamente e antes das curvas de referência, outras três amostras coletadas próximas umas das outras permitirão estimar o tempo de vida médio do cRBC.

3. PLANO EXPERIMENTAL

   3.1 Tipo de estudo Ensaio de viabilidade clínica.

   3.2 Plano experimental

   O estudo será realizado em 4 fases:

   1. produção in vitro do equivalente a 1mL de sangue, ou seja, 5x109 hemácias enucleadas, a partir de células mononucleares isoladas de um enxerto de HSC obtido de um doador benevolente saudável,
   2. marcação destes eritrócitos com 51Cr, de acordo com o protocolo clássico usado para estudar o tempo de vida dos glóbulos vermelhos,
   3. reinjeção de hemácias autólogas no mesmo doador,
   4. acompanhamento do receptor por um período máximo de 33 dias para medir a meia-vida das células injetadas.
4. CARACTERÍSTICAS DOS RECEPTORES 4.1 Descrição da população do estudo A escolha de realizar o estudo em voluntários saudáveis ​​e não em pacientes baseia-se na necessidade de ter um contexto fisiológico saudável evitando qualquer situação que possa levar à hemólise. Como o protocolo exige mobilização com fator de crescimento, os doadores de células-tronco periféricas (CSP) recebem G-CSF.

Os receptores voluntários serão recrutados entre doadores intrafamiliares de CEP, a fim de evitar a exposição desnecessária de um doador saudável ao G-CSF.

No âmbito da mobilização das HSC, receberão durante 5 dias injeções subcutâneas de G-CSF na dose de 10 µg/kg de peso corporal.

4.1.1 Coleta de células mononucleares por citaferese

Características do material de partida:

Células-tronco hematopoiéticas de sangue periférico não serão retiradas para produção de hemácias cultivadas, a menos que o enxerto destinado ao paciente contenha > 7x106 células CD34+/kg de peso corporal do paciente receptor, sendo a dose celular estabelecida na literatura como suficiente para reconstituir a hematopoiese de um paciente recebendo um enxerto alogênico. Assim, o protocolo de pesquisa não acarretará perda de chance para o paciente.

4.1.2 Isolamento de células CD34+ para o protocolo As células CD34+ a serem utilizadas para pesquisa serão selecionadas em uma coluna de seleção imunomagnética positiva utilizando um sistema Isolex®. Um mínimo de 45x106 células CD34+ é necessário para o bom funcionamento do sistema. Esses fatores limitantes nos obrigam a usar como material de partida células-tronco mobilizadas com G-CSF. Após a retirada desta amostra para o estudo, o enxerto deverá conter no mínimo 7x106 células CD34+/kg de peso corporal do paciente.

O material de partida pós-seleção consistirá em células CD34+ de grau clínico purificadas por seleção imunomagnética. Uma pureza de mais de 50% de células CD34+ deve ser obtida após a seleção imunomagnética. A porcentagem de células viáveis ​​será determinada pela coloração com azul de tripano. As células CD34+ purificadas serão congeladas em solução de albumina 4% contendo DMSO 10% e acondicionadas em criotubos de 2,5 mL contendo 1x106 células CD34+. Após o descongelamento, a viabilidade celular deve ser superior a 50%.

Um mínimo de 1 milhão de células CD34+ viáveis ​​é necessário para a semeadura em cultura no dia 0.

4.1.3 Caracterização biológica do cRBC

O princípio ativo é o cRBC filtrado e o produto final cRBC marcado com 51Cr. Como o produto deve ser reinjetado imediatamente após a rotulagem, a caracterização será realizada quanto ao princípio ativo e envolverá os seguintes elementos:

O princípio ativo deve consistir em:

1. RBC caracterizado por:

   • sua morfologia (em lâminas coradas com May-Grunwald-Giemsa),
   • seu conteúdo de hemoglobina (MHC > 25 pg medido em um autômato Sysmex XE-2100) (ver 3.2.S.4.3);
2. eritroblastos acidófilos < 1,2% (em > 10.000 células contadas em lâmina);
3. à exclusão de todos os outros tipos de células em > 10.000 células contadas em uma lâmina.

4.1.4 Critérios suficientes do princípio ativo (cRBC)

O produto será rotulado com cromo se apresentar as seguintes características:

• 5 a 10x109 RBC com MHC > 25 pg,
• < 1,2% de eritroblastos acidófilos,
• ausência de leucócitos. Os restantes controlos microbiológicos serão conhecidos a posteriori.

4.1.5 Rotulagem com cromo 51

Esta etapa será realizada na clínica de medicina nuclear. A rotulagem é realizada:

• usando uma suspensão de cRBC,
• e uma solução estéril de [51Cr] cromato de sódio com uma atividade de 37 MBq/mL na calibração.

O próprio procedimento de rotulagem é realizado sob condições clinicamente estéreis. A suspensão é injetada em frações de 0,3 mL (restrição ligada à medição da atividade de 51Cr das seringas antes da injeção) usando seringas de 2 mL fechadas com rolha. O volume máximo reinjetado será de 5 mL por via intravenosa.

4.1.6 Critérios suficientes do produto final rotulado com 51Cr

O produto rotulado será injetado no voluntário sadio se apresentar as seguintes características:

• atividade 51Cr entre 2.500 KBq (mínimo) e 5.000 KBq (máximo),
• uma ausência de 51Cr não ligado às células.

4.1.7 Injeção em receptores Esta etapa ocorrerá dentro de 2 meses após a coleta de células-tronco. Injeção intravenosa direta de hemácias marcadas no volume de 1 mL, em sala reservada para administração de drogas radioativas, situada na clínica de medicina nuclear e contígua ao laboratório de preparação, por questões regulamentares.

Manutenção de via venosa até o final do período de vigilância. Coleta de 2 amostras de 10 mL de sangue em EDTA por punção venosa na dobra do cotovelo, em T+1h e T+3h após a injeção.

Critérios para alta do ambulatório: ausência de febre ou calafrios, pressão arterial normal e exame clínico normal.

Duração total da vigilância pós-injeção: 4 horas.

4.2 Planejamento das consultas para mensuração do tempo de vida da hemácias A coleta de amostras de 10 mL por punção venosa na dobra do cotovelo e o acompanhamento dos receptores serão realizados no CIC St Antoine.

Transferência dos tubos para a clínica de medicina nuclear.

• A terceira amostra será coletada T+24h após a injeção.
• As 3 seguintes serão tomadas em dias escolhidos de acordo com o decaimento estimado a partir das primeiras amostras (entre T+48h e T+30 dias após a injeção).

A falta de estabelecimento de datas fixas de amostragem é justificada pela necessidade de adaptação à cinética dessa população homogênea de eritrócitos, até o momento desconhecida.

Um exame clínico será realizado em cada consulta. Após a realização das medições, as amostras serão destruídas.

Em conclusão, esta abordagem tem várias vantagens:

1. Evita injetar um fator de crescimento, G-CSF, em um voluntário saudável apenas para os objetivos do estudo.
2. A situação autóloga evita qualquer risco imunológico e qualquer risco de transmissão de agentes infecciosos.
3. O 51Cr é um emissor de radiação gama de energia 320 keV e tem um período radioativo de 27,7 dias. A irradiação resultante deste estudo não envolve risco mensurável. Nenhuma precaução radioprotetora especial precisa ser considerada, tanto para o receptor quanto para aqueles em contato com ele.