Kultivované červené krvinky: Studie životnosti in vivo (GRc2008)

1. OBECNÉ ZÁSADY

   1.1 Produkce cRBC klinického stupně V této studii je cRBC aktivní složkou i konečným produktem podrobeným značení radioaktivním chrómem.

   Množství 5x109 cRBC, které má být reinjektováno, je určeno nutností mít množství radioaktivity v rozmezí 2500 až 5000 kBq, aby byla zajištěna dostatečná citlivost pro měření délky života.

   1.2 Testovaná hypotéza Protože cRBC mají in vitro všechny funkční charakteristiky nativních RBC, předpokládá se, že budou životaschopné in vivo.

   Tato životaschopnost bude hodnocena měřením jejich životnosti. Bude porovnána s uváděnou životností nativních červených krvinek, tj. 30+3 dny.

2. CÍLE STUDIE

   2.1 Hlavní cíl Studie délky života kultivovaných červených krvinek in vivo.

   2.2 Kritéria hodnocení

   2.2.1 Princip: Hlavním kritériem je naměřená životnost cRBC. Bude porovnána s uváděnou životností nativních červených krvinek, tj. 30+3 dny.

   Studie zahrnuje označení kohorty cRBC: po podání tato kohorta cRBC zestárne v cirkulující krvi a poté zmizí na konci své „životnosti“. Výsledky budou interpretovány následujícím způsobem:

   - pokud radioaktivita prvních 3 vzorků krve zůstane konstantní (po korekci na rozpad), bude to považováno za důkaz ve prospěch nepřítomnosti předčasné destrukce buněk.

   Následující 3 vzorky budou odebrány později [v limitu 30 dnů, po kterém již nebude možné měření radioaktivity vzorků z důvodu rozpadu chromu 51, eliminace chromu z buněk rychlostí 1,2 % za den a nepřesnost počtu radioaktivních látek pro velmi nízké aktivity]. Jeden dospěje k závěru, že životnost cRBC je delší než 33 dní.

   - pokud se u prvních 3 vzorků radioaktivita sníží významně a dříve než na referenčních křivkách, tři další vzorky odebrané blízko sebe umožní odhad střední délky života cRBC.

3. EXPERIMENTÁLNÍ PLÁN

   3.1 Typ studie Test klinické proveditelnosti.

   3.2 Experimentální plán

   Studie bude probíhat ve 4 fázích:

   1. produkce in vitro ekvivalentu 1 ml krve, tj. 5x109 enukleovaných RBC, z mononukleárních buněk izolovaných z HSC štěpu získaného od zdravého benevolentního dárce,
   2. značení těchto cRBC pomocí 51Cr podle klasického protokolu používaného ke studiu délky života červených krvinek,
   3. reinjekce autologního cRBC stejnému dárci,
   4. sledování příjemce po maximální dobu 33 dnů pro měření poločasu života injikovaných buněk.
4. CHARAKTERISTIKA PŘIJÍMAČŮ 4.1 Popis studované populace Volba provedení studie na zdravých dobrovolnících a nikoli na pacientech je založena na nutnosti mít zdravý fyziologický kontext a vyhnout se jakékoli situaci, která by mohla vést k hemolýze. Protože protokol vyžaduje mobilizaci růstovým faktorem, dárci periferních kmenových buněk (PSC) dostávají G-CSF.

Dobrovolní příjemci budou rekrutováni mezi intra-familiárními dárci PSC, aby se zabránilo zbytečnému vystavení zdravého dárce G-CSF.

V rámci mobilizace HSC budou dostávat po dobu 5 dnů subkutánní injekce G-CSF v dávce 10 ug/kg tělesné hmotnosti.

4.1.1 Odběr mononukleárních buněk cytaferézou

Vlastnosti výchozího materiálu:

Hematopoetické kmenové buňky z periferní krve nebudou odebrány pro produkci kultivovaných červených krvinek, pokud štěp určený pro pacienta neobsahuje > 7x106 CD34+ buněk/kg tělesné hmotnosti příjemce pacienta, přičemž dávka buněk stanovená v literatuře jako dostatečná k rekonstituci krvetvorby pacienta, který dostává alogenní štěp. Proto protokol výzkumu nezpůsobí pro pacienta žádnou ztrátu šance.

4.1.2 Izolace CD34+ buněk pro protokol CD34+ buňky, které mají být použity pro výzkum, budou vybrány na pozitivní imunomagnetické selekční koloně pomocí systému Isolex®. Pro dobré fungování systému je potřeba minimálně 45x106 CD34+ buněk. Tyto limitující faktory nás nutí používat jako výchozí materiál kmenové buňky mobilizované s G-CSF. Po odebrání tohoto vzorku pro studii bude muset štěp obsahovat minimálně 7x106 CD34+ buněk/kg tělesné hmotnosti pacienta.

Výchozí materiál po selekci bude obsahovat CD34+ buňky klinického stupně purifikované imunomagnetickou selekcí. Po imunomagnetické selekci by měla být získána čistota více než 50 % CD34+ buněk. Procento životaschopných buněk bude stanoveno barvením trypanovou modří. Purifikované CD34+ buňky budou zmraženy ve 4% roztoku albuminu obsahujícím 10% DMSO a upraveny v 2,5ml kryozkumavkách obsahujících 1x106 CD34+ buněk. Po rozmrazení by měla být životaschopnost buněk více než 50 %.

Pro naočkování do kultury v den 0 je nutný minimálně 1 milion životaschopných CD34+ buněk.

4.1.3 Biologická charakterizace cRBC

Aktivní složkou je filtrovaný cRBC a konečný produkt cRBC značený 51Cr. Vzhledem k tomu, že přípravek by měl být znovu vstříknut ihned po označení, bude charakterizace provedena na aktivním principu a bude zahrnovat následující prvky:

Aktivní princip by měl obsahovat:

1. RBC se vyznačuje:

   • jejich morfologie (na sklíčkách barvených May-Grunwald-Giemsa),
   • jejich obsah hemoglobinu (MHC > 25 pg měřeno v automatu Sysmex XE-2100) (viz 3.2.S.4.3);
2. acidofilní erytroblasty < 1,2 % (u > 10 000 buněk počítaných na sklíčku);
3. s vyloučením všech ostatních typů buněk v > 10 000 buňkách počítaných na sklíčku.

4.1.4 Dostatečná kritéria účinné látky (cRBC)

Výrobek bude označen chromem, pokud má následující vlastnosti:

• 5 až 10x109 RBC s MHC > 25 pg,
• < 1,2 % acidofilních erytroblastů,
• nepřítomnost leukocytů. Zbývající mikrobiologické kontroly budou známy a posteriori.

4.1.5 Označení chromem 51

Tento krok bude proveden na klinice nukleární medicíny. Označení se provádí:

• pomocí suspenze cRBC,
• a sterilní roztok [51Cr] chromanu sodného s aktivitou 37 MBq/ml při kalibraci.

Samotný postup značení se provádí za klinicky sterilních podmínek. Suspenze se injikuje v 0,3 ml frakcích (omezení spojené s měřením aktivity 51Cr v injekčních stříkačkách před injekcí) pomocí 2ml injekčních stříkaček uzavřených zátkou. Maximální reinjektovaný objem bude 5 ml intravenózní cestou.

4.1.6 Dostatečná kritéria konečného produktu označeného 51Cr

Označený přípravek bude injekčně podán zdravému dobrovolníkovi, pokud vykazuje následující vlastnosti:

• Aktivita 51Cr mezi 2 500 KBq (minimum) a 5 000 KBq (maximum),
• nepřítomnost 51Cr nevázaného na buňky.

4.1.7 Injekce do přijímačů Tento krok proběhne do 2 měsíců po odběru kmenových buněk. Přímá intravenózní injekce značeného cRBC v objemu 1 ml do místnosti vyhrazené pro podávání radioaktivních léků, která se nachází na klinice nukleární medicíny a sousedí s přípravnou laboratoří z regulačních důvodů.

Udržování žilní cesty do konce období sledování. Odběr 2 vzorků po 10 ml krve do EDTA žilní punkcí v ohybu lokte v T+1h a T+3h po injekci.

Kritéria pro propuštění z kliniky: nepřítomnost horečky nebo třesavky, normální krevní tlak a normální klinické vyšetření.

Celková doba sledování po injekci: 4 hodiny.

4.2 Plánování schůzek pro měření životnosti cRBC Odběr 10 ml vzorků žilní punkcí v ohybu lokte a sledování přijímačů bude provedeno v CIC St Antoine.

Převoz hadiček na kliniku nukleární medicíny.

• Třetí vzorek bude odebrán T+24h po injekci.
• Následující 3 budou odebrány ve dnech vybraných podle rozpadu odhadnutého z prvních vzorků (mezi T+48h a T+30 dny po injekci).

Neexistence stanovení pevných termínů odběru vzorků je odůvodněna nutností přizpůsobit se kinetice této homogenní populace cRBC, která je v současnosti neznámá.

Při každé schůzce bude provedeno klinické vyšetření. Po provedení měření budou vzorky zničeny.

Závěrem lze říci, že tento přístup má několik výhod:

1. Vyhýbá se injekčnímu podávání růstového faktoru, G-CSF, zdravému dobrovolníkovi pro jediný cíl studie.
2. Autologní situace zabraňuje jakémukoli imunologickému riziku a riziku přenosu infekčních agens.
3. 51Cr je zářičem gama záření o energii 320 keV a má radioaktivní periodu 27,7 dne. Ozáření vyplývající z této studie nezahrnuje žádné měřitelné riziko. Není třeba uvažovat o žádných zvláštních radioprotektivních opatřeních, ať už pro přijímač, ani pro osoby, které jsou s ním v kontaktu.