Glóbulos rojos cultivados: Estudio de vida útil in vivo (GRc2008)

1. GENERALIDADES

   1.1 Producción de grado clínico de cRBC En este estudio, el cRBC es tanto el principio activo como el producto final sujeto al marcado con cromo radiactivo.

   La cantidad de 5x109 cRBC a reinyectar está determinada por la necesidad de tener una cantidad de radiactividad comprendida entre 2500 y 5000 kBq para tener suficiente sensibilidad para medir la duración de la vida.

   1.2 Hipótesis contrastada Dado que los glóbulos rojos c tienen in vitro todas las características funcionales de los glóbulos rojos nativos, se plantea la hipótesis de que serán viables in vivo.

   Esta viabilidad se evaluará midiendo su vida útil. Se comparará con la vida útil informada de los glóbulos rojos nativos, es decir, 30+3 días.

2. OBJETIVOS DEL ESTUDIO

   2.1 Objetivo principal Estudio de la vida útil in vivo de los glóbulos rojos cultivados.

   2.2 Criterios de evaluación

   2.2.1 Principal: El criterio principal es la vida útil medida del cRBC. Se comparará con la vida útil informada de los glóbulos rojos nativos, es decir, 30+3 días.

   El estudio consiste en etiquetar una cohorte de cRBC: después de la administración, esta cohorte de cRBC envejecerá en la sangre circulante y luego desaparecerá al final de su "vida útil". Los resultados se interpretarán de la siguiente manera:

   - si la radiactividad de las primeras 3 muestras de sangre permanece constante (después de la corrección por deterioro), esto se tomará como evidencia a favor de la ausencia de destrucción celular prematura.

   Las 3 muestras siguientes se extraerán más tarde [dentro del límite de 30 días, después de lo cual ya no será posible medir la radiactividad de las muestras debido a la descomposición del cromo 51, eliminación del cromo de las células a razón del 1,2 % por día y falta de precisión del recuento radiactivo para actividades muy bajas]. Se concluirá que la vida útil del cRBC es superior a 33 días.

   - si, en las 3 primeras muestras, la radiactividad disminuye de manera significativa y antes que en las curvas de referencia, otras tres muestras tomadas juntas permitirán estimar la vida media de los cRBC.

3. PLAN EXPERIMENTAL

   3.1 Tipo de estudio Ensayo de viabilidad clínica.

   3.2 Plan experimental

   El estudio se realizará en 4 fases:

   1. producción in vitro del equivalente a 1 ml de sangre, es decir, 5x109 glóbulos rojos enucleados, a partir de células mononucleares aisladas de un injerto de HSC obtenido de un donante benévolo sano,
   2. etiquetado de estos cRBC con 51Cr, de acuerdo con el protocolo clásico utilizado para estudiar la vida útil de los glóbulos rojos,
   3. reinyección del cRBC autólogo en el mismo donante,
   4. seguimiento del receptor durante un máximo de 33 días para medir la vida media de las células inyectadas.
4. CARACTERÍSTICAS DE LOS RECEPTORES 4.1 Descripción de la población de estudio La elección de realizar el estudio en voluntarios sanos y no en pacientes se basa en la necesidad de contar con un contexto fisiológico saludable evitando cualquier situación que pueda conducir a la hemólisis. Como el protocolo requiere la movilización con un factor de crecimiento, los donantes de células madre periféricas (PSC) reciben G-CSF.

Los receptores voluntarios serán reclutados entre donantes intrafamiliares de PSC, para evitar la exposición innecesaria de un donante sano a G-CSF.

En el contexto de la movilización de HSC, recibirán durante 5 días inyecciones subcutáneas de G-CSF a una dosis de 10 µg/kg de peso corporal.

4.1.1 Recolección de células mononucleares por citaféresis

Características del material de partida:

No se tomarán células madre hematopoyéticas de sangre periférica para la producción de cultivos de glóbulos rojos a menos que el injerto destinado al paciente contenga > 7x106 células CD34+/kg de peso corporal del paciente receptor, siendo la dosis celular establecida en la literatura como suficiente para reconstituir la hematopoyesis de un paciente que recibe un injerto alogénico. Por lo tanto, el protocolo de investigación no supondrá una pérdida de oportunidad para el paciente.

4.1.2 Aislamiento de células CD34+ para el protocolo Las células CD34+ que se utilizarán para la investigación se seleccionarán en una columna de selección inmunomagnética positiva mediante un sistema Isolex®. Se necesita un mínimo de 45x106 células CD34+ para el buen funcionamiento del sistema. Estos factores limitantes nos obligan a utilizar como material de partida células madre movilizadas con G-CSF. Tras la extracción de esta muestra para el estudio, el injerto deberá contener un mínimo de 7x106 células CD34+/kg de peso corporal del paciente.

El material de partida posterior a la selección consistirá en células CD34+ de calidad clínica purificadas mediante selección inmunomagnética. Se debe obtener una pureza de más del 50 % de células CD34+ después de la selección inmunomagnética. El porcentaje de células viables se determinará mediante tinción con azul de tripano. Las células CD34+ purificadas se congelarán en una solución de albúmina al 4 % que contiene DMSO al 10 % y se acondicionarán en criotubos de 2,5 ml que contienen 1x106 células CD34+. Después de la descongelación, la viabilidad celular debe ser superior al 50 %.

Se necesita un mínimo de 1 millón de células CD34+ viables para sembrar en cultivo el día 0.

4.1.3 Caracterización biológica del cRBC

El principio activo es cRBC filtrado y el producto final cRBC marcado con 51Cr. Dado que el producto debe reinyectarse inmediatamente después del etiquetado, la caracterización se realizará sobre el principio activo y comprenderá los siguientes elementos:

El principio activo debe consistir en:

1. RBC caracterizado por:

   • su morfología (en portaobjetos teñidos con May-Grunwald-Giemsa),
   • su contenido de hemoglobina (MHC > 25 pg medido en un autómata Sysmex XE-2100) (ver 3.2.S.4.3);
2. eritroblastos acidófilos < 1,2 % (en > 10 000 células contadas en un portaobjetos);
3. con exclusión de todos los demás tipos de células en > 10.000 células contadas en un portaobjetos.

4.1.4 Criterio suficiente del principio activo (cRBC)

El producto se etiquetará con cromo si presenta las siguientes características:

• 5 a 10x109 RBC con MHC > 25 pg,
• < 1,2% de eritroblastos acidófilos,
• ausencia de leucocitos. El resto de controles microbiológicos se conocerán a posteriori.

4.1.5 Etiquetado con cromo 51

Este paso se realizará en la clínica de medicina nuclear. El etiquetado se realiza:

• usando una suspensión de cRBC,
• y una solución estéril de [51Cr] cromato de sodio con una actividad de 37 MBq/mL en la calibración.

El procedimiento de marcaje en sí se realiza en condiciones clínicamente estériles. La suspensión se inyecta en fracciones de 0,3 mL (restricción ligada a la medición de la actividad de 51Cr de las jeringas antes de la inyección) utilizando jeringas de 2 mL cerradas con un tapón. El volumen máximo reinyectado será de 5 mL por vía intravenosa.

4.1.6 Criterios suficientes del producto final etiquetado con 51Cr

El producto etiquetado se inyectará en el voluntario sano si presenta las siguientes características:

• Actividad de 51Cr entre 2500 KBq (mínimo) y 5000 KBq (máximo),
• una ausencia de 51Cr no unido a las células.

4.1.7 Inyección en receptores Este paso tendrá lugar dentro de los 2 meses posteriores a la recolección de células madre. Inyección intravenosa directa de cRBC marcados en un volumen de 1 mL, en una sala reservada para la administración de fármacos radiactivos, situada en la clínica de medicina nuclear y contigua al laboratorio de preparación, por motivos normativos.

Mantenimiento de una vía venosa hasta el final del período de vigilancia. Recogida de 2 muestras de 10 mL de sangre en EDTA por punción venosa en el pliegue del codo, a T+1h y T+3h después de la inyección.

Criterios de alta de la clínica: ausencia de fiebre o escalofríos, tensión arterial normal y exploración clínica normal.

Duración total de la vigilancia post-inyección: 4 horas.

4.2 Planificación de las citas para la medición de la vida útil de los cRBC La recolección de muestras de 10 mL por punción venosa en el pliegue del codo y el seguimiento de los receptores se realizarán en el CIC St Antoine.

Traslado de los tubos a la clínica de medicina nuclear.

• La tercera muestra se tomará T+24h después de la inyección.
• Las 3 siguientes se tomarán en días elegidos según el decaimiento estimado a partir de las primeras muestras (entre T+48h y T+30 días después de la inyección).

La falta de establecimiento de fechas fijas de muestreo se justifica por la necesidad de adaptarse a la cinética de esta población homogénea de eritrocitos, actualmente desconocida.

En cada cita se realizará un examen clínico. Después de realizar las mediciones, las muestras serán destruidas.

En conclusión, este enfoque tiene varias ventajas:

1. Evita inyectar un factor de crecimiento, G-CSF, en un voluntario sano con los únicos objetivos del estudio.
2. La situación autóloga evita cualquier riesgo inmunológico y cualquier riesgo de transmisión de agentes infecciosos.
3. El 51Cr es un emisor de radiación gamma de energía 320 keV y tiene un periodo radiactivo de 27,7 días. La irradiación resultante de este estudio no implica ningún riesgo medible. No es necesario prever precauciones particulares de radioprotección, ni para el receptor ni para quienes están en contacto con él.