Culture de globules rouges : étude sur la durée de vie in vivo (GRc2008)

1. GENERALITES

   1.1 Production de qualité clinique de cRBC Dans cette étude, le cRBC est à la fois le principe actif et le produit final soumis à un marquage au chrome radioactif.

   La quantité de 5x109 érythrocytes à réinjecter est déterminée par la nécessité d'avoir une quantité de radioactivité comprise entre 2500 et 5000 kBq afin d'avoir une sensibilité suffisante pour mesurer la durée de vie.

   1.2 Hypothèse testée Puisque les globules rouges possèdent in vitro toutes les caractéristiques fonctionnelles des globules rouges natifs, on émet l'hypothèse qu'ils seront viables in vivo.

   Cette viabilité sera évaluée en mesurant leur durée de vie. Elle sera comparée à la durée de vie rapportée des GR natifs, c'est-à-dire 30+3 jours.

2. OBJECTIFS DE L'ÉTUDE

   2.1 Objectif principal Etude de la durée de vie in vivo des globules rouges en culture.

   2.2 Critères d'évaluation

   2.2.1 Principal : Le critère principal est la durée de vie mesurée du GRc. Elle sera comparée à la durée de vie rapportée des GR natifs, c'est-à-dire 30+3 jours.

   L'étude consiste à marquer une cohorte d'érythrocytes : après administration, cette cohorte d'érythrocytes va vieillir dans le sang circulant puis disparaître à la fin de sa « durée de vie ». Les résultats seront interprétés de la manière suivante :

   - si la radioactivité des 3 premiers prélèvements sanguins reste constante (après correction de la décroissance), cela sera considéré comme une preuve en faveur d'une absence de destruction cellulaire prématurée.

   Les 3 échantillons suivants seront prélevés ultérieurement [dans la limite de 30 jours, après quoi la mesure de la radioactivité des échantillons ne sera plus possible du fait de la décroissance du chrome 51, élimination du chrome des cellules à raison de 1,2% par jour et imprécision du comptage radioactif pour les très faibles activités]. On conclura que la durée de vie du CRB est supérieure à 33 jours.

   - si, dans les 3 premiers échantillons, la radioactivité diminue de manière significative et plus tôt que sur les courbes de référence, trois autres échantillons prélevés à proximité permettront d'estimer la durée de vie moyenne du GRc.

3. PLAN EXPÉRIMENTAL

   3.1 Type d'étude Essai de faisabilité clinique.

   3.2 Plan expérimental

   L'étude se déroulera en 4 phases :

   1. production in vitro de l'équivalent de 1mL de sang, soit 5x109 GR énucléés, à partir de cellules mononucléées isolées d'un greffon de CSH provenant d'un donneur sain bienveillant,
   2. marquage de ces érythrocytes au 51Cr, selon le protocole classique utilisé pour étudier la durée de vie des globules rouges,
   3. réinjection du globule rouge autologue au même donneur,
   4. suivi du receveur pendant une durée maximale de 33 jours pour mesurer la demi-vie des cellules injectées.
4. CARACTERISTIQUES DES RECEVEURS 4.1 Description de la population d'étude Le choix de mener l'étude chez des volontaires sains et non chez des patients repose sur la nécessité d'avoir un contexte physiologique sain évitant toute situation pouvant conduire à une hémolyse. Le protocole nécessitant une mobilisation avec un facteur de croissance, les donneurs de cellules souches périphériques (PSC) reçoivent du G-CSF.

Les receveurs volontaires seront recrutés parmi les donneurs intra-familiaux de PSC, afin d'éviter l'exposition inutile d'un donneur sain au G-CSF.

Dans le cadre de la mobilisation des CSH, ils recevront pendant 5 jours des injections sous-cutanées de G-CSF à la dose de 10 µg/kg de poids corporel.

4.1.1 Collecte de cellules mononucléaires par cytaphérèse

Caractéristiques de la matière première :

Les cellules souches hématopoïétiques du sang périphérique ne seront prélevées pour la production de globules rouges en culture que si le greffon destiné au patient contient > 7x106 cellules CD34+/kg de poids corporel du patient receveur, la dose cellulaire établie dans la littérature comme étant suffisante pour reconstituer l'hématopoïèse d'un patient recevant une greffe allogénique. Ainsi le protocole de recherche n'entraînera aucune perte de chance pour le patient.

4.1.2 Isolement des cellules CD34+ pour le protocole Les cellules CD34+ à utiliser pour la recherche seront sélectionnées sur une colonne de sélection immunomagnétique positive à l'aide d'un système Isolex®. Un minimum de 45x106 cellules CD34+ est nécessaire au bon fonctionnement du système. Ces facteurs limitants nous obligent à utiliser comme matière première des cellules souches mobilisées avec le G-CSF. Après prélèvement de cet échantillon pour l'étude, le greffon devra contenir un minimum de 7x106 cellules CD34+/kg de poids corporel du patient.

Le matériel de départ post-sélection sera composé de cellules CD34+ de qualité clinique purifiées par sélection immunomagnétique. Une pureté supérieure à 50 % des cellules CD34+ doit être obtenue après sélection immunomagnétique. Le pourcentage de cellules viables sera déterminé par coloration au bleu trypan. Les cellules CD34+ purifiées seront congelées dans une solution d'albumine à 4% contenant 10% de DMSO et conditionnées dans des cryotubes de 2,5 mL contenant 1x106 cellules CD34+. Après décongélation, la viabilité cellulaire doit être supérieure à 50 %.

Un minimum de 1 million de cellules CD34+ viables est nécessaire pour l'ensemencement en culture au jour 0.

4.1.3 Caractérisation biologique du cRB

Le principe actif est filtré cRBC et le produit final cRBC marqué au 51Cr. Le produit devant être réinjecté immédiatement après étiquetage, la caractérisation sera réalisée sur le principe actif et comportera les éléments suivants :

Le principe actif doit consister en :

1. GR caractérisé par :

   • leur morphologie (sur lames colorées au May-Grunwald-Giemsa),
   • leur teneur en hémoglobine (CMH > 25 pg mesuré dans un automate Sysmex XE-2100) (voir 3.2.S.4.3) ;
2. érythroblastes acidophiles < 1,2 % (sur > 10 000 cellules comptées sur lame) ;
3. à l'exclusion de tout autre type cellulaire dans > 10 000 cellules comptées sur une lame.

4.1.4 Critères suffisants du principe actif (cRB)

Le produit sera étiqueté avec du chrome s'il présente les caractéristiques suivantes :

• 5 à 10x109 GR avec CMH > 25 pg,
• < 1,2 % d'érythroblastes acidophiles,
• une absence de leucocytes. Les contrôles microbiologiques restants seront connus a posteriori.

4.1.5 Marquage au chrome 51

Cette étape sera réalisée à la clinique de médecine nucléaire. L'étiquetage est effectué :

• à l'aide d'une suspension de cRB,
• et une solution stérile de [51Cr] chromate de sodium ayant une activité de 37 MBq/mL à l'étalonnage.

La procédure de marquage elle-même est réalisée dans des conditions cliniquement stériles. La suspension est injectée par fractions de 0,3 mL (contrainte liée à la mesure de l'activité 51Cr des seringues avant injection) à l'aide de seringues de 2 mL fermées par un bouchon. Le volume maximal réinjecté sera de 5 mL par voie intraveineuse.

4.1.6 Critères suffisants du produit final étiqueté au 51Cr

Le produit marqué sera injecté au volontaire sain s'il présente les caractéristiques suivantes :

• Activité 51Cr entre 2 500 KBq (minimum) et 5 000 KBq (maximum),
• une absence de 51Cr non lié aux cellules.

4.1.7 Injection dans les récepteurs Cette étape aura lieu dans les 2 mois suivant le prélèvement des cellules souches. Injection intraveineuse directe de globules rouges marqués dans un volume de 1 mL, dans une salle réservée à l'administration de médicaments radioactifs, située dans la clinique de médecine nucléaire et attenante au laboratoire de préparation, pour des raisons réglementaires.

Maintien d'une voie veineuse jusqu'à la fin de la période de surveillance. Prélèvement de 2 échantillons de 10 mL de sang sur EDTA par ponction veineuse au pli du coude, à T+1h et T+3h après injection.

Critères de sortie de la clinique : absence de fièvre ou de frissons, tension artérielle normale et examen clinique normal.

Durée totale de la surveillance post-injection : 4 heures.

4.2 Planification des rendez-vous pour la mesure de la durée de vie des érythrocytes Le prélèvement de 10 mL d'échantillons par ponction veineuse au pli du coude et le suivi des receveurs seront effectués au CIC St Antoine.

Transfert des tubes à la clinique de médecine nucléaire.

• Le troisième échantillon sera prélevé T+24h après l'injection.
• Les 3 suivants seront prélevés à des jours choisis en fonction de la décroissance estimée à partir des premiers prélèvements (entre T+48h et T+30 jours après injection).

L'absence d'établissement de dates fixes de prélèvement se justifie par la nécessité de s'adapter à la cinétique de cette population homogène d'érythroblastopénie, actuellement inconnue.

Un examen clinique sera effectué à chaque rendez-vous. Après avoir effectué les mesures, les échantillons seront détruits.

En conclusion, cette approche présente plusieurs avantages :

1. Elle évite d'injecter un facteur de croissance, le G-CSF, à un volontaire sain pour les seuls objectifs de l'étude.
2. La situation autologue évite tout risque immunologique et tout risque de transmission d'agents infectieux.
3. Le 51Cr est un émetteur de rayonnement gamma d'énergie 320 keV et a une période radioactive de 27,7 jours. L'irradiation résultant de cette étude ne comporte aucun risque mesurable. Aucune précaution particulière de radioprotection n'est à prévoir, ni pour le récepteur ni pour les personnes en contact avec lui.