Культивируемые эритроциты: исследование продолжительности жизни in vivo (GRc2008)

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

   1.1 Производство cRBC клинической чистоты В этом исследовании cRBC является как активным началом, так и конечным продуктом, подвергнутым мечению радиоактивным хромом.

   Количество 5x109 cRBC, подлежащее повторной инъекции, определяется необходимостью наличия уровня радиоактивности между 2500 и 5000 кБк, чтобы иметь достаточную чувствительность для измерения продолжительности жизни.

   1.2 Проверка гипотезы Поскольку cRBC in vitro обладают всеми функциональными характеристиками нативных RBC, предполагается, что они будут жизнеспособны in vivo.

   Эта жизнеспособность будет оцениваться путем измерения продолжительности их жизни. Это будет сравниваться с заявленной продолжительностью жизни нативных эритроцитов, т.е. 30 + 3 дня.

2. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

   2.1 Основная цель Изучение продолжительности жизни in vivo культивируемых эритроцитов.

   2.2 Критерии оценки

   2.2.1 Принципиальный: Основным критерием является измеренный срок службы cRBC. Это будет сравниваться с заявленной продолжительностью жизни нативных эритроцитов, т.е. 30 + 3 дня.

   Исследование включает в себя маркировку когорты cRBC: после введения эта когорта cRBC будет стареть в циркулирующей крови, а затем исчезнет в конце своего «срока жизни». Результаты будут интерпретированы следующим образом:

   - если радиоактивность первых 3-х проб крови останется постоянной (после поправки на распад), это будет считаться свидетельством отсутствия преждевременной гибели клеток.

   Следующие 3 пробы будут взяты позже [в пределах 30 дней, после чего измерение радиоактивности проб будет невозможно из-за распада хрома 51, выведения хрома из клеток в размере 1,2% в день и отсутствие точности радиоактивного подсчета для очень низких активностей]. Можно сделать вывод, что продолжительность жизни cRBC превышает 33 дня.

   - если в первых трех образцах радиоактивность снижается значительно и раньше, чем на контрольных кривых, три других образца, взятые близко друг к другу, позволят оценить среднюю продолжительность жизни cRBC.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПЛАН

   3.1 Тип исследования Анализ клинической осуществимости.

   3.2 Экспериментальный план

   Исследование будет проходить в 4 этапа:

   1. производство in vitro эквивалента 1 мл крови, т.е. 5x109 энуклеированных эритроцитов, из мононуклеарных клеток, выделенных из трансплантата HSC, полученного от здорового доброжелательного донора,
   2. мечение этих cRBC 51Cr в соответствии с классическим протоколом, используемым для изучения продолжительности жизни эритроцитов,
   3. реинъекция аутологичных cRBC тому же донору,
   4. последующее наблюдение за приемником в течение максимальной продолжительности 33 дня для измерения периода полураспада введенных клеток.
4. ХАРАКТЕРИСТИКИ УЧАСТНИКОВ 4.1 Описание исследуемой популяции Выбор проведения исследования на здоровых добровольцах, а не на пациентах, основан на необходимости иметь здоровый физиологический контекст, избегая любой ситуации, которая может привести к гемолизу. Поскольку протокол требует мобилизации фактора роста, доноры периферических стволовых клеток (ПСК) получают Г-КСФ.

Добровольные получатели будут набраны среди внутрисемейных доноров ПСХ, чтобы избежать ненужного воздействия Г-КСФ на здорового донора.

В рамках мобилизации ГСК им будут в течение 5 дней подкожно вводить Г-КСФ в дозе 10 мкг/кг массы тела.

4.1.1 Сбор мононуклеарных клеток методом цитафереза

Характеристики исходного материала:

Гематопоэтические стволовые клетки периферической крови не будут использоваться для производства культивируемых эритроцитов, за исключением случаев, когда трансплантат, предназначенный для пациента, содержит > 7x106 клеток CD34+/кг массы тела пациента-получателя, доза клеток, установленная в литературе как достаточная для восстановления кроветворения. пациента, получающего аллогенный трансплантат. Таким образом, протокол исследования не повлечет за собой потери шансов для пациента.

4.1.2 Выделение клеток CD34+ для протокола. Клетки CD34+, которые будут использоваться для исследования, будут отобраны на колонке положительной иммуномагнитной селекции с использованием системы Isolex®. Для хорошего функционирования системы необходимо минимум 45x106 клеток CD34+. Эти ограничивающие факторы обязывают нас использовать в качестве исходного материала стволовые клетки, мобилизованные Г-КСФ. После забора этого образца для исследования трансплантат должен содержать не менее 7х106 клеток CD34+/кг массы тела пациента.

Исходный материал после селекции будет состоять из клеток CD34+ клинической чистоты, очищенных с помощью иммуномагнитной селекции. После иммуномагнитной селекции должна быть получена чистота более 50% клеток CD34+. Процент жизнеспособных клеток определяют окрашиванием трипановым синим. Очищенные клетки CD34+ замораживают в 4% растворе альбумина, содержащем 10% ДМСО, и кондиционируют в криопробирках объемом 2,5 мл, содержащих 1×106 клеток CD34+. После оттаивания жизнеспособность клеток должна быть более 50%.

Для посева в культуру в день 0 необходимо минимум 1 миллион жизнеспособных клеток CD34+.

4.1.3 Биологическая характеристика cRBC

Активное начало представляет собой отфильтрованные cRBC, а конечный продукт cRBC помечен 51Cr. Поскольку продукт следует повторно ввести сразу же после маркировки, характеристика будет проводиться на основе активного начала и будет включать следующие элементы:

Активный принцип должен состоять из:

1. РБК характеризуется:

   • их морфология (на предметных стеклах, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе),
   • их содержание гемоглобина (MHC > 25 пг, измеренное на автомате Sysmex XE-2100) (см. 3.2.S.4.3);
2. ацидофильные эритробласты < 1,2% (в > 10 000 клеток, подсчитанных на предметном стекле);
3. с исключением всех других типов клеток в > 10 000 клеток, подсчитанных на предметном стекле.

4.1.4 Достаточные критерии активного начала (cRBC)

Продукт будет помечен хромом, если он имеет следующие характеристики:

• от 5 до 10x109 эритроцитов с MHC > 25 пг,
• < 1,2% ацидофильных эритробластов,
• отсутствие лейкоцитов. Остальные микробиологические средства контроля будут известны апостериори.

4.1.5 Маркировка хромом 51

Этот шаг будет выполняться в клинике ядерной медицины. Маркировка осуществляется:

• с использованием суспензии cRBC,
• и стерильный раствор хромата натрия [51Cr], имеющий активность 37 МБк/мл при калибровке.

Сама процедура маркировки проводится в клинически стерильных условиях. Суспензию вводят фракциями по 0,3 мл (ограничение, связанное с измерением активности 51Cr в шприцах перед инъекцией), используя шприцы на 2 мл, закрытые пробкой. Максимальный объем реинъекции будет составлять 5 мл при внутривенном введении.

4.1.6 Достаточные критерии конечного продукта, маркированного 51Cr

Маркированный продукт будет введен здоровому добровольцу, если он обладает следующими характеристиками:

• активность 51Cr от 2500 КБк (минимум) до 5000 КБк (максимум),
• отсутствие 51Cr, не связанного с клетками.

4.1.7 Введение в ресивер Этот этап будет выполнен в течение 2 месяцев после забора стволовых клеток. Прямая внутривенная инъекция меченых cRBC в объеме 1 мл в помещении, предназначенном для введения радиоактивных препаратов, расположенном в клинике ядерной медицины и прилегающем к лаборатории подготовки, по нормативным причинам.

Сохранение венозного пути до конца периода наблюдения. Сбор 2 образцов по 10 мл крови в ЭДТА путем венозной пункции на сгибе локтя, в Т+1ч и Т+3ч после инъекции.

Критерии выписки из клиники: отсутствие лихорадки или озноба, нормальное АД и нормальное клиническое обследование.

Общая продолжительность постинъекционного наблюдения: 4 часа.

4.2 Планирование назначений для измерения продолжительности жизни cRBC Сбор 10 мл образцов путем венозной пункции на сгибе локтя и последующее наблюдение за получателями будет осуществляться в CIC St Antoine.

Передача пробирок в клинику ядерной медицины.

• Третий образец будет взят через 24 часа после инъекции.
• Следующие 3 будут взяты в дни, выбранные в соответствии с распадом, оцененным по первым образцам (между Т+48ч и Т+30 дней после инъекции).

Отсутствие установления фиксированных дат отбора проб объясняется необходимостью адаптации к кинетике этой гомогенной популяции cRBC, которая в настоящее время неизвестна.

При каждом посещении будет проводиться клинический осмотр. После проведения измерений образцы уничтожаются.

В заключение, этот подход имеет несколько преимуществ:

1. Он позволяет избежать введения фактора роста, G-CSF, здоровому добровольцу исключительно для целей исследования.
2. Аутологичная ситуация позволяет избежать любого иммунологического риска и любого риска передачи инфекционных агентов.
3. 51Cr является излучателем гамма-излучения с энергией 320 кэВ и имеет радиоактивный период 27,7 суток. Облучение, полученное в результате этого исследования, не связано с измеримым риском. Не требуется никаких особых мер радиозащиты ни для приемника, ни для лиц, контактирующих с ним.