Gekweekte rode bloedcellen: onderzoek naar de levensduur in vivo (GRc2008)

1. ALGEMEEN

   1.1 Klinische productie van cRBC In deze studie is de cRBC zowel het actieve bestanddeel als het eindproduct dat wordt onderworpen aan radioactieve chroomlabeling.

   De te herinjecteren hoeveelheid 5x109 cRBC wordt bepaald door de noodzaak om een ​​hoeveelheid radioactiviteit te hebben die ligt tussen 2500 en 5000 kBq om voldoende gevoeligheid te hebben om de levensduur te meten.

   1.2 Hypothese getest Aangezien de cRBC in vitro alle functionele kenmerken hebben van natieve RBC, wordt verondersteld dat ze in vivo levensvatbaar zullen zijn.

   Deze levensvatbaarheid zal worden geëvalueerd door hun levensduur te meten. Het wordt vergeleken met de gerapporteerde levensduur van native RBC, d.w.z. 30+3 dagen.

2. DOELSTELLINGEN VAN HET ONDERZOEK

   2.1 Hoofddoel Studie van de levensduur in vivo van gekweekte rode bloedcellen.

   2.2 Beoordelingscriteria

   2.2.1 Opdrachtgever: Het belangrijkste criterium is de gemeten levensduur van de CVC. Het wordt vergeleken met de gerapporteerde levensduur van native RBC, d.w.z. 30+3 dagen.

   De studie omvat het labelen van een cohort van cRBC: na toediening zal dit cohort van cRBC in het circulerende bloed verouderen en aan het einde van zijn "levensduur" verdwijnen. De resultaten worden op de volgende manier geïnterpreteerd:

   - als de radioactiviteit van de eerste 3 bloedmonsters constant blijft (na correctie voor verval), wordt dit beschouwd als bewijs voor de afwezigheid van voortijdige celvernietiging.

   De volgende 3 monsters zullen later worden genomen [binnen de limiet van 30 dagen, waarna meting van de radioactiviteit van de monsters niet meer mogelijk is vanwege het verval van chroom 51, verwijdering van chroom uit de cellen met een snelheid van 1,2% per dag en gebrek aan precisie van de radioactieve telling voor zeer lage activiteiten]. Men zal concluderen dat de levensduur van de cRBC langer is dan 33 dagen.

   - als bij de eerste 3 monsters de radioactiviteit aanzienlijk afneemt en eerder dan op de referentiecurven, kunnen drie andere monsters dicht bij elkaar genomen worden om een ​​schatting te maken van de gemiddelde levensduur van de cRBC.

3. EXPERIMENTEEL PLAN

   3.1 Soort onderzoek Klinische haalbaarheidstest.

   3.2 Experimenteel plan

   Het onderzoek zal in 4 fasen worden uitgevoerd:

   1. productie in vitro van het equivalent van 1 ml bloed, d.w.z. 5x109 ontkernde RBC, uit mononucleaire cellen geïsoleerd uit een HSC-transplantaat verkregen van een gezonde welwillende donor,
   2. labeling van deze cRBC met 51Cr, volgens het klassieke protocol dat wordt gebruikt om de levensduur van rode bloedcellen te bestuderen,
   3. herinjectie van de autologe cRBC in dezelfde donor,
   4. follow-up van de ontvanger gedurende maximaal 33 dagen om de halfwaardetijd van de geïnjecteerde cellen te meten.
4. KENMERKEN VAN DE ONTVANGERS 4.1 Beschrijving van de onderzoekspopulatie De keuze om het onderzoek uit te voeren bij gezonde vrijwilligers en niet bij patiënten is gebaseerd op de noodzaak om een ​​gezonde fysiologische context te hebben waarbij elke situatie wordt vermeden die tot hemolyse zou kunnen leiden. Aangezien het protocol mobilisatie met een groeifactor vereist, ontvangen de donoren van perifere stamcellen (PSC) G-CSF.

De vrijwillige ontvangers zullen worden geworven onder intrafamiliale donoren van PSC, om onnodige blootstelling van een gezonde donor aan G-CSF te voorkomen.

In het kader van de mobilisatie van HSC krijgen ze gedurende 5 dagen subcutane injecties van G-CSF in een dosis van 10 µg/kg lichaamsgewicht.

4.1.1 Verzameling van mononucleaire cellen door cytaferese

Kenmerken van het uitgangsmateriaal:

Hematopoëtische stamcellen uit perifeer bloed zullen niet worden afgenomen voor de productie van gekweekte erytrocyten, tenzij het voor de patiënt bestemde transplantaat > 7x106 CD34+-cellen/kg lichaamsgewicht van de ontvangende patiënt bevat, waarbij de in de literatuur vastgestelde celdosis voldoende is om de hematopoëse te reconstitueren. van een patiënt die een allogeen transplantaat krijgt. Zo zal het onderzoeksprotocol geen kansverlies voor de patiënt met zich meebrengen.

4.1.2 Isolatie van CD34+-cellen voor het protocol De voor onderzoek te gebruiken CD34+-cellen zullen worden geselecteerd op een positieve immunomagnetische selectiekolom met behulp van een Isolex®-systeem. Voor een goede werking van het systeem zijn minimaal 45x106 CD34+ cellen nodig. Deze beperkende factoren dwingen ons om stamcellen gemobiliseerd met G-CSF als uitgangsmateriaal te gebruiken. Na verwijdering van dit monster voor de studie moet het transplantaat minimaal 7x106 CD34+ cellen/kg lichaamsgewicht van de patiënt bevatten.

Het uitgangsmateriaal na selectie zal bestaan ​​uit CD34+-cellen van klinische kwaliteit, gezuiverd door immunomagnetische selectie. Na immunomagnetische selectie moet een zuiverheid van meer dan 50% CD34+-cellen worden verkregen. Het percentage levensvatbare cellen wordt bepaald door kleuring met trypaanblauw. De gezuiverde CD34+-cellen worden ingevroren in een 4% albumine-oplossing met 10% DMSO en geconditioneerd in 2,5 ml cryobuisjes met 1x106 CD34+-cellen. Na ontdooien zou de levensvatbaarheid van de cellen meer dan 50% moeten zijn.

Er zijn minimaal 1 miljoen levensvatbare CD34+-cellen nodig om op dag 0 in kweek te zaaien.

4.1.3 Biologische karakterisering van de cRBC

Het actieve bestanddeel is gefilterd cRBC en het eindproduct is cRBC gelabeld met 51Cr. Aangezien het product onmiddellijk na etikettering opnieuw moet worden geïnjecteerd, zal de karakterisering worden uitgevoerd op basis van het actieve bestanddeel en de volgende elementen omvatten:

Het actieve principe zou moeten bestaan ​​uit:

1. RBC gekenmerkt door:

   • hun morfologie (op dia's gekleurd met May-Grunwald-Giemsa),
   • hun hemoglobinegehalte (MHC > 25 pg gemeten in een Sysmex XE-2100-automaat) (zie 3.2.S.4.3);
2. acidofiele erytroblasten < 1,2% (in > 10.000 cellen geteld op een glaasje);
3. met uitsluiting van alle andere celtypen in > 10.000 cellen geteld op een glaasje.

4.1.4 Voldoende criteria van de werkzame stof (cRBC)

Het product wordt gelabeld met chroom als het de volgende kenmerken vertoont:

• 5 tot 10x109 RBC met MHC > 25 pg,
• < 1,2% acidofiele erytroblasten,
• afwezigheid van leukocyten. De overige microbiologische controles zullen a posteriori bekend zijn.

4.1.5 Etikettering met chroom 51

Deze stap wordt uitgevoerd in de kliniek voor nucleaire geneeskunde. Etikettering wordt uitgevoerd:

• met behulp van een suspensie van cRBC,
• en een steriele oplossing van [51Cr] natriumchromaat met een activiteit van 37 MBq/ml bij kalibratie.

De etiketteringsprocedure zelf wordt uitgevoerd onder klinisch steriele omstandigheden. De suspensie wordt geïnjecteerd in fracties van 0,3 ml (beperking gekoppeld aan meting van de 51Cr-activiteit van de spuiten vóór injectie) met behulp van spuiten van 2 ml die zijn afgesloten met een stop. Het maximale volume dat opnieuw wordt geïnjecteerd, is 5 ml via intraveneuze weg.

4.1.6 Voldoende criteria van het eindproduct gelabeld met 51Cr

Het gelabelde product zal in de gezonde vrijwilliger worden geïnjecteerd als het de volgende kenmerken vertoont:

• 51Cr-activiteit tussen 2.500 KBq (minimum) en 5.000 KBq (maximum),
• een afwezigheid van 51Cr niet gebonden aan cellen.

4.1.7 Injectie in ontvangers Deze stap vindt plaats binnen 2 maanden na stamcelverzameling. Directe intraveneuze injectie van gelabeld cRBC in een volume van 1 ml, in een ruimte gereserveerd voor de toediening van radioactieve geneesmiddelen, gelegen in de kliniek voor nucleaire geneeskunde en grenzend aan het bereidingslaboratorium, om wettelijke redenen.

Onderhoud van een veneuze route tot het einde van de bewakingsperiode. Verzameling van 2 monsters van 10 ml bloed in EDTA door veneuze punctie in de bocht van de elleboog, op T+1u en T+3u na injectie.

Criteria voor ontslag uit de kliniek: afwezigheid van koorts of rillingen, normale bloeddruk en normaal klinisch onderzoek.

Totale duur van de post-injectiebewaking: 4 uur.

4.2 Planning van de afspraken voor meting van de levensduur van cRBC Afname van monsters van 10 mL door veneuze punctie in de bocht van de elleboog en opvolging van de ontvangers zal gebeuren in het CIC St Antoine.

Overdracht van de buisjes naar de kliniek voor nucleaire geneeskunde.

• Het derde monster wordt T+24u na injectie genomen.
• De volgende 3 zullen worden genomen op dagen gekozen op basis van het geschatte verval op basis van de eerste monsters (tussen T+48u en T+30 dagen na injectie).

Het ontbreken van vaste bemonsteringsdata wordt gerechtvaardigd door de noodzaak om zich aan te passen aan de kinetiek van deze homogene populatie van CRBC, die momenteel onbekend is.

Bij elke afspraak wordt een klinisch onderzoek uitgevoerd. Na het uitvoeren van de metingen worden de monsters vernietigd.

Concluderend heeft deze aanpak verschillende voordelen:

1. Het vermijdt het injecteren van een groeifactor, G-CSF, in een gezonde vrijwilliger voor de enige doelstellingen van de studie.
2. De autologe situatie vermijdt elk immunologisch risico en elk risico op overdracht van besmettelijke agentia.
3. 51Cr is een zender van gammastraling met een energie van 320 keV en heeft een radioactieve periode van 27,7 dagen. De bestraling die voortvloeit uit dit onderzoek houdt geen meetbaar risico in. Er hoeven geen bijzondere radiobeschermende voorzorgsmaatregelen te worden genomen, noch voor de ontvanger, noch voor degenen die met hem in contact staan.