Hodowane krwinki czerwone: badanie długości życia in vivo (GRc2008)

1. UWAGI OGÓLNE

   1.1 Wytwarzanie cRBC klasy klinicznej W tym badaniu cRBC jest zarówno substancją czynną, jak i produktem końcowym poddanym znakowaniu radioaktywnym chromem.

   Ilość 5x109 cRBC do ponownego wstrzyknięcia jest określona przez konieczność posiadania ilości radioaktywności leżącej między 2500 a 5000 kBq, aby mieć wystarczającą czułość do pomiaru długości życia.

   1.2 Sprawdzona hipoteza Ponieważ cRBC mają in vitro wszystkie cechy funkcjonalne natywnych RBC, zakłada się, że będą one zdolne do życia in vivo.

   Ta żywotność zostanie oceniona poprzez pomiar ich żywotności. Zostanie ona porównana ze zgłoszoną długością życia natywnych KKCz, tj. 30+3 dni.

2. CELE BADANIA

   2.1 Główny cel Badanie długości życia in vivo hodowanych krwinek czerwonych.

   2.2 Kryteria oceny

   2.2.1 Zasada: Głównym kryterium jest zmierzona długość życia cRBC. Zostanie ona porównana ze zgłoszoną długością życia natywnych KKCz, tj. 30+3 dni.

   Badanie obejmuje znakowanie kohorty cRBC: po podaniu ta kohorta cRBC starzeje się we krwi krążącej, a następnie znika pod koniec swojego „okresu życia”. Wyniki będą interpretowane w następujący sposób:

   - jeśli radioaktywność pierwszych 3 próbek krwi pozostaje stała (po uwzględnieniu rozkładu), zostanie to uznane za dowód na rzecz braku przedwczesnego zniszczenia komórek.

   Kolejne 3 próbki zostaną pobrane później [w terminie 30 dni, po którym pomiar radioaktywności próbek nie będzie już możliwy ze względu na rozpad chromu 51, eliminację chromu z ogniw w tempie 1,2% na dzień i brak precyzji zliczania promieniotwórczości dla bardzo niskich aktywności]. Można dojść do wniosku, że żywotność cRBC jest większa niż 33 dni.

   - jeśli w pierwszych 3 próbkach radioaktywność spada znacząco i wcześniej niż na krzywych referencyjnych, to trzy kolejne próbki pobrane blisko siebie pozwolą oszacować średni czas życia cRBC.

3. PLAN EKSPERYMENTALNY

   3.1 Rodzaj badania Test wykonalności klinicznej.

   3.2 Plan eksperymentu

   Badanie zostanie przeprowadzone w 4 etapach:

   1. wytworzenie in vitro ekwiwalentu 1 ml krwi, tj. 5x109 pozbawionych jąder krwinek czerwonych, z komórek jednojądrzastych wyizolowanych z przeszczepu HSC uzyskanego od zdrowego, życzliwego dawcy,
   2. znakowanie tych cRBC 51Cr, zgodnie z klasycznym protokołem stosowanym do badania żywotności krwinek czerwonych,
   3. ponowne wstrzyknięcie autologicznego cRBC temu samemu dawcy,
   4. obserwacja biorcy przez maksymalnie 33 dni w celu zmierzenia okresu półtrwania wstrzykniętych komórek.
4. CHARAKTERYSTYKA BIORCY 4.1 Charakterystyka badanej populacji Wybór przeprowadzenia badania na zdrowych ochotnikach, a nie na pacjentach, wynika z konieczności zachowania zdrowego kontekstu fizjologicznego, unikania sytuacji mogących prowadzić do hemolizy. Ponieważ protokół wymaga mobilizacji czynnikiem wzrostu, dawcy obwodowych komórek macierzystych (PSC) otrzymują G-CSF.

Ochotniczy biorcy będą rekrutowani spośród wewnątrzrodzinnych dawców PSC, aby uniknąć niepotrzebnego narażenia zdrowego dawcy na G-CSF.

W ramach mobilizacji HSC otrzymają oni przez 5 dni podskórne iniekcje G-CSF w dawce 10 µg/kg masy ciała.

4.1.1 Pobieranie komórek jednojądrzastych metodą cytaferezy

Charakterystyka materiału wyjściowego:

Krwiotwórcze komórki macierzyste krwi obwodowej nie będą pobierane do produkcji hodowli krwinek czerwonych, chyba że przeszczep przeznaczony dla pacjenta zawiera > 7x106 komórek CD34+/kg masy ciała pacjenta biorcy, dawka komórek określona w literaturze jako wystarczająca do odtworzenia hematopoezy pacjenta otrzymującego przeszczep allogeniczny. W ten sposób protokół badania nie spowoduje utraty szansy dla pacjenta.

4.1.2 Izolacja komórek CD34+ na potrzeby protokołu Komórki CD34+ przeznaczone do badań zostaną wyselekcjonowane na pozytywnej immunomagnetycznej kolumnie selekcyjnej przy użyciu systemu Isolex®. Do prawidłowego funkcjonowania systemu niezbędne jest minimum 45x106 komórek CD34+. Te czynniki ograniczające zmuszają nas do wykorzystania jako materiału wyjściowego komórek macierzystych mobilizowanych G-CSF. Po pobraniu tej próbki do badań, przeszczep będzie musiał zawierać co najmniej 7x106 komórek CD34+/kg masy ciała pacjenta.

Materiał wyjściowy po selekcji będzie składał się z komórek CD34+ klasy klinicznej oczyszczonych przez selekcję immunomagnetyczną. Po selekcji immunomagnetycznej należy uzyskać czystość powyżej 50% komórek CD34+. Procent żywotnych komórek zostanie określony przez barwienie błękitem trypanu. Oczyszczone komórki CD34+ zostaną zamrożone w 4% roztworze albuminy zawierającym 10% DMSO i kondycjonowane w 2,5 ml krioprobówkach zawierających 1x106 komórek CD34+. Po rozmrożeniu żywotność komórek powinna wynosić ponad 50%.

Do wysiania w hodowli w dniu 0 niezbędny jest co najmniej 1 milion żywotnych komórek CD34+.

4.1.3 Charakterystyka biologiczna cRBC

Substancją czynną jest filtrowany cRBC, a produkt końcowy cRBC znakowany 51Cr. Ponieważ produkt należy ponownie wstrzyknąć natychmiast po oznakowaniu, charakterystyka zostanie przeprowadzona na substancji czynnej i będzie obejmowała następujące elementy:

Substancja czynna powinna składać się z:

1. RBC charakteryzuje się:

   • ich morfologia (na preparatach barwionych preparatem May-Grunwald-Giemsa),
   • ich zawartość hemoglobiny (MHC > 25 pg zmierzona w aparacie Sysmex XE-2100) (patrz 3.2.S.4.3);
2. erytroblasty kwasochłonne < 1,2% (w > 10 000 komórek zliczonych na szkiełku);
3. z wyłączeniem wszystkich innych typów komórek w > 10 000 komórek zliczonych na szkiełku.

4.1.4 Wystarczające kryteria substancji czynnej (cRBC)

Produkt będzie oznaczony chromem, jeśli będzie miał następujące właściwości:

• 5 do 10x109 RBC z MHC > 25 pg,
• < 1,2% kwasochłonne erytroblasty,
• brak leukocytów. Pozostałe kontrole mikrobiologiczne będą znane a posteriori.

4.1.5 Oznakowanie chromem 51

Ten krok zostanie wykonany w klinice medycyny nuklearnej. Etykietowanie odbywa się:

• stosując zawiesinę cRBC,
• oraz sterylny roztwór chromianu [51Cr] sodu o aktywności kalibracyjnej 37 MBq/ml.

Sama procedura znakowania odbywa się w klinicznie sterylnych warunkach. Zawiesinę wstrzykuje się we frakcjach po 0,3 ml (ograniczenie związane z pomiarem aktywności 51Cr strzykawek przed wstrzyknięciem) za pomocą 2 ml strzykawek zamkniętych korkiem. Maksymalna ponownie wstrzyknięta objętość wynosi 5 ml drogą dożylną.

4.1.6 Wystarczające kryteria produktu końcowego oznaczonego 51Cr

Oznakowany produkt zostanie wstrzyknięty zdrowemu ochotnikowi, jeśli wykazuje następujące cechy:

• aktywność 51Cr od 2500 KBq (minimum) do 5000 KBq (maksimum),
• brak 51Cr niezwiązanego z komórkami.

4.1.7 Iniekcja do biorców Ten krok zostanie przeprowadzony w ciągu 2 miesięcy po pobraniu komórek macierzystych. Bezpośrednie dożylne wstrzyknięcie znakowanych cRBC w objętości 1 ml, w pomieszczeniu przeznaczonym do podawania leków radioaktywnych, znajdującym się w poradni medycyny nuklearnej i przylegającym do laboratorium preparacyjnego, ze względów regulacyjnych.

Utrzymanie drogi żylnej do końca okresu obserwacji. Pobranie 2 próbek po 10 ml krwi do EDTA przez nakłucie żylne w zgięciu łokcia, w T+1h i T+3h po wstrzyknięciu.

Kryteria wypisu z kliniki: brak gorączki lub dreszczy, prawidłowe ciśnienie krwi i prawidłowe badanie kliniczne.

Całkowity czas nadzoru po iniekcji: 4 godziny.

4.2 Planowanie wizyt w celu pomiaru żywotności cRBC Pobieranie 10 ml próbek przez nakłucie żylne w zgięciu łokcia i obserwacja biorców będzie prowadzona w CIC St Antoine.

Przekazanie probówek do kliniki medycyny nuklearnej.

• Trzecia próbka zostanie pobrana T+24h po wstrzyknięciu.
• Kolejne 3 zostaną pobrane w dniach wybranych zgodnie z rozkładem oszacowanym na podstawie pierwszych próbek (między T+48h a T+30 dni po iniekcji).

Brak ustalenia stałych terminów pobierania prób jest uzasadniony koniecznością dostosowania się do kinetyki tej jednorodnej populacji cRBC, obecnie nieznanej.

Na każdej wizycie przeprowadzane jest badanie kliniczne. Po wykonaniu pomiarów próbki zostaną zniszczone.

Podsumowując, takie podejście ma kilka zalet:

1. Unika się wstrzykiwania czynnika wzrostu, G-CSF, zdrowemu ochotnikowi wyłącznie dla celów badania.
2. Sytuacja autologiczna pozwala uniknąć jakiegokolwiek ryzyka immunologicznego i jakiegokolwiek ryzyka przeniesienia czynników zakaźnych.
3. 51Cr jest emiterem promieniowania gamma o energii 320 keV i ma okres radioaktywności 27,7 dni. Napromieniowanie wynikające z tego badania nie wiąże się z żadnym mierzalnym ryzykiem. Nie trzeba przewidywać żadnych szczególnych środków ochrony radiologicznej ani dla odbiorcy, ani dla osób mających z nim kontakt.