Odlade röda blodkroppar: livslängd in vivo-studie (GRc2008)

1. ALLMÄNT

   1.1 Produktion av cRBC i klinisk kvalitet I denna studie är cRBC både den aktiva beståndsdelen och slutprodukten som utsätts för radioaktiv krommärkning.

   Mängden 5x109 cRBC som ska återinjiceras bestäms av nödvändigheten av att ha en mängd radioaktivitet som ligger mellan 2500 och 5000 kBq för att ha tillräcklig känslighet för att mäta livslängden.

   1.2 Testade hypoteser Eftersom cRBC har in vitro alla funktionella egenskaper hos naturligt RBC, antas det att de kommer att vara livskraftiga in vivo.

   Denna livskraft kommer att utvärderas genom att mäta deras livslängd. Den kommer att jämföras med den rapporterade livslängden för naturligt RBC, dvs 30+3 dagar.

2. STUDIENS MÅL

   2.1 Huvudmål Studie av livslängden in vivo för odlade röda blodkroppar.

   2.2 Utvärderingskriterier

   2.2.1 Principal: Huvudkriteriet är den uppmätta livslängden för cRBC. Den kommer att jämföras med den rapporterade livslängden för naturligt RBC, dvs 30+3 dagar.

   Studien involverar märkning av en kohort av cRBC: efter administrering kommer denna kohort av cRBC att åldras i det cirkulerande blodet och sedan försvinna i slutet av sin "livslängd". Resultaten kommer att tolkas på följande sätt:

   - om radioaktiviteten i de första 3 blodproverna förblir konstant (efter korrigering för sönderfall), kommer detta att tas som bevis till förmån för en frånvaro av för tidig celldestruktion.

   Följande 3 prover kommer att tas senare [inom gränsen på 30 dagar, varefter mätning av provernas radioaktivitet inte längre kommer att vara möjlig på grund av sönderfallet av krom 51, eliminering av krom från cellerna med en hastighet av 1,2 % per dag och bristande precision av det radioaktiva antalet för mycket låga aktiviteter]. Man kommer att dra slutsatsen att livslängden för cRBC är överlägsen 33 dagar.

   - om radioaktiviteten i de första 3 proverna minskar på ett signifikant sätt och tidigare än på referenskurvorna, kommer tre andra prov som tagits nära varandra att göra det möjligt att uppskatta medellivslängden för cRBC.

3. EXPERIMENTELL PLAN

   3.1 Typ av studie Klinisk genomförbarhetsanalys.

   3.2 Experimentplan

   Studien kommer att genomföras i fyra faser:

   1. produktion in vitro av motsvarande 1 ml blod, dvs. 5x109 enucleated RBC, från mononukleära celler isolerade från ett HSC-transplantat erhållet från en frisk välvillig donator,
   2. märkning av dessa cRBC med 51Cr, enligt det klassiska protokollet som används för att studera livslängden för röda blodkroppar,
   3. återinjektion av det autologa cRBC i samma donator,
   4. uppföljning av mottagaren under en maximal varaktighet av 33 dagar för att mäta halveringstiden för de injicerade cellerna.
4. MOTTAGARNAS EGENSKAPER 4.1 Beskrivning av studiepopulationen Valet att genomföra studien på friska frivilliga och inte på patienter baseras på nödvändigheten av att ha ett hälsosamt fysiologiskt sammanhang för att undvika situationer som kan leda till hemolys. Eftersom protokollet kräver mobilisering med en tillväxtfaktor får donatorerna av perifera stamceller (PSC) G-CSF.

De frivilliga mottagarna kommer att rekryteras bland intrafamiliella donatorer av PSC, för att undvika onödig exponering av en frisk donator för G-CSF.

I samband med mobiliseringen av HSC kommer de under 5 dagar att få subkutana injektioner av G-CSF i en dos av 10 µg/kg kroppsvikt.

4.1.1 Samling av mononukleära celler genom cytaferes

Kännetecken för utgångsmaterialet:

Hematopoetiska stamceller från perifert blod kommer inte att tas för produktion av odlade RBC om inte transplantatet som är avsett för patienten innehåller > 7x106 CD34+-celler/kg kroppsvikt hos patientmottagaren, den celldos som i litteraturen fastställts som tillräcklig för att rekonstituera hematopoiesen av en patient som får ett allogent transplantat. Således kommer forskningsprotokollet inte att medföra någon chansförlust för patienten.

4.1.2 Isolering av CD34+-celler för protokollet CD34+-cellerna som ska användas för forskning kommer att väljas på en positiv immunomagnetisk selektionskolonn med hjälp av ett Isolex®-system. Ett minimum av 45x106 CD34+-celler är nödvändigt för att systemet ska fungera bra. Dessa begränsande faktorer tvingar oss att som utgångsmaterial använda stamceller mobiliserade med G-CSF. Efter avlägsnande av detta prov för studien måste transplantatet innehålla minst 7x106 CD34+-celler/kg kroppsvikt hos patienten.

Utgångsmaterialet efter selektion kommer att bestå av CD34+-celler av klinisk kvalitet renade genom immunomagnetisk selektion. En renhet på mer än 50 % CD34+-celler bör erhållas efter immunomagnetiskt urval. Procentandelen livskraftiga celler kommer att bestämmas genom färgning med trypanblått. De renade CD34+-cellerna kommer att frysas i en 4% albuminlösning innehållande 10% DMSO och konditioneras i 2,5 ml kryorör innehållande 1x106 CD34+-celler. Efter upptining bör cellviabiliteten vara mer än 50 %.

Minst 1 miljon livsdugliga CD34+-celler är nödvändiga för sådd i kultur på dag 0.

4.1.3 Biologisk karakterisering av cRBC

Den aktiva beståndsdelen är filtrerad cRBC och slutprodukten cRBC märkt med 51Cr. Eftersom produkten ska återinjiceras omedelbart efter märkning, kommer karakteriseringen att utföras på den aktiva beståndsdelen och kommer att innefatta följande element:

Den aktiva principen bör bestå av:

1. RBC kännetecknas av:

   • deras morfologi (på objektglas färgade med May-Grunwald-Giemsa),
   • deras hemoglobinhalt (MHC > 25 pg mätt i en Sysmex XE-2100 automat) (se 3.2.S.4.3);
2. acidofila erytroblaster < 1,2 % (i > 10 000 celler räknat på ett objektglas);
3. med undantag för alla andra celltyper i > 10 000 celler räknade på ett objektglas.

4.1.4 Tillräckliga kriterier för den aktiva beståndsdelen (cRBC)

Produkten kommer att märkas med krom om den har följande egenskaper:

• 5 till 10x109 RBC med MHC > 25 pg,
• < 1,2 % acidofila erytroblaster,
• frånvaro av leukocyter. De återstående mikrobiologiska kontrollerna kommer att vara kända i efterhand.

4.1.5 Märkning med krom 51

Detta steg kommer att utföras på den nuklearmedicinska kliniken. Märkning utförs:

• med användning av en suspension av cRBC,
• och en steril lösning av [51Cr] natriumkromat med en aktivitet av 37 MBq/ml vid kalibrering.

Själva märkningsproceduren utförs under kliniskt sterila förhållanden. Suspensionen injiceras i 0,3 ml fraktioner (restriktion kopplad till mätning av 51Cr-aktiviteten hos sprutorna före injektion) med användning av 2 ml sprutor förslutna med en propp. Den maximala volymen som återinjiceras kommer att vara 5 ml intravenöst.

4.1.6 Tillräckliga kriterier för slutprodukten märkt med 51Cr

Den märkta produkten kommer att injiceras i den friska frivilliga om den uppvisar följande egenskaper:

• 51Cr-aktivitet mellan 2 500 KBq (minst) och 5 000 KBq (maximalt),
• en frånvaro av 51Cr som inte är bunden till celler.

4.1.7 Injektion i mottagare Detta steg kommer att ske inom 2 månader efter stamcellsinsamling. Direkt intravenös injektion av märkt cRBC i en volym av 1 mL, i ett rum reserverat för administrering av radioaktiva läkemedel, beläget på nuklearmedicinska kliniken och i anslutning till beredningslaboratoriet, av regulatoriska skäl.

Underhåll av en venös väg till slutet av övervakningsperioden. Samling av 2 prover på 10 ml blod till EDTA genom venpunktion vid böjningen av armbågen, vid T+1h och T+3h efter injektion.

Kriterier för utskrivning från kliniken: frånvaro av feber eller frossa, normalt blodtryck och normal klinisk undersökning.

Total varaktighet av övervakningen efter injektion: 4 timmar.

4.2 Planering av möten för mätning av livslängden för cRBC Samling av 10 ml prover genom venpunktion vid böjningen av armbågen och uppföljning av mottagarna kommer att utföras på CIC St Antoine.

Överföring av rören till nuklearmedicinsk klinik.

• Det tredje provet tas T+24h efter injektion.
• Följande 3 kommer att tas på dagar som väljs enligt det uppskattade sönderfallet från de första proverna (mellan T+48h och T+30 dagar efter injektion).

Avsaknaden av fastställande av fasta datum för provtagning motiveras av nödvändigheten att anpassa sig till kinetiken för denna homogena population av cRBC, för närvarande okänd.

En klinisk undersökning kommer att utföras vid varje besök. Efter att mätningarna har utförts kommer proverna att förstöras.

Sammanfattningsvis har detta tillvägagångssätt flera fördelar:

1. Den undviker att injicera en tillväxtfaktor, G-CSF, i en frisk volontär för studiens enda syfte.
2. Den autologa situationen undviker alla immunologiska risker och risker för överföring av smittämnen.
3. 51Cr är en utsändare av gammastrålning med energi 320 keV och har en radioaktiv period på 27,7 dagar. Bestrålningen från denna studie innebär ingen mätbar risk. Inga speciella strålskyddsåtgärder behöver övervägas, varken för mottagaren eller för dem som är i kontakt med honom.