Globuli rossi in coltura: studio sulla durata della vita in vivo (GRc2008)

1. GENERALITÀ

   1.1 Produzione di cRBC di grado clinico In questo studio il cRBC è sia il principio attivo che il prodotto finale sottoposto a marcatura con cromo radioattivo.

   La quantità di 5x109 cRBC da reiniettare è determinata dalla necessità di avere una quantità di radioattività compresa tra 2500 e 5000 kBq per avere una sensibilità sufficiente a misurare la durata della vita.

   1.2 Ipotesi testata Poiché i cRBC hanno in vitro tutte le caratteristiche funzionali dei globuli rossi nativi, si ipotizza che siano vitali in vivo.

   Questa fattibilità sarà valutata misurando la loro durata di vita. Sarà confrontato con la durata della vita riportata di RBC nativi, ovvero 30+3 giorni.

2. OBIETTIVI DELLO STUDIO

   2.1 Obiettivo principale Studio della durata della vita in vivo di globuli rossi in coltura.

   2.2 Criteri di valutazione

   2.2.1 Principale: il criterio principale è la durata di vita misurata del cRBC. Sarà confrontato con la durata della vita riportata di RBC nativi, ovvero 30+3 giorni.

   Lo studio prevede l'etichettatura di una coorte di cRBC: dopo la somministrazione, questa coorte di cRBC invecchierà nel sangue circolante e poi scomparirà alla fine della sua "durata di vita". I risultati saranno interpretati nel seguente modo:

   - se la radioattività dei primi 3 campioni di sangue rimane costante (dopo la correzione per decadimento), ciò sarà preso come prova a favore dell'assenza di distruzione prematura delle cellule.

   Successivamente verranno prelevati i successivi 3 campioni [entro il limite di 30 giorni, decorsi i quali non sarà più possibile misurare la radioattività dei campioni a causa del decadimento del cromo 51, eliminazione del cromo dalle cellule in ragione dell'1,2% al giorno e imprecisione del conteggio radioattivo per attività molto basse]. Si concluderà che la durata della vita del cRBC è superiore a 33 giorni.

   - se nei primi 3 prelievi la radioattività diminuisce in modo significativo ed in anticipo rispetto alle curve di riferimento, altri tre prelievi ravvicinati consentiranno di stimare la vita media dei cRBC.

3. PIANO SPERIMENTALE

   3.1 Tipo di studio Saggio di fattibilità clinica.

   3.2 Piano sperimentale

   Lo studio si svolgerà in 4 fasi:

   1. produzione in vitro dell'equivalente di 1 mL di sangue, cioè 5x109 RBC enucleati, da cellule mononucleari isolate da un innesto di HSC ottenuto da un donatore sano benevolo,
   2. marcatura di questi cRBC con 51Cr, secondo il protocollo classico utilizzato per studiare la durata della vita dei globuli rossi,
   3. reiniezione di eritrociti autologhi nello stesso donatore,
   4. follow-up del ricevente per una durata massima di 33 giorni per misurare l'emivita delle cellule iniettate.
4. CARATTERISTICHE DEI RICEVENTI 4.1 Descrizione della popolazione in studio La scelta di condurre lo studio su volontari sani e non su pazienti è basata sulla necessità di avere un contesto fisiologico sano evitando qualsiasi situazione che possa portare all'emolisi. Poiché il protocollo richiede la mobilizzazione con un fattore di crescita, i donatori di cellule staminali periferiche (PSC) ricevono G-CSF.

I riceventi volontari saranno reclutati tra i donatori intra-familiari di PSC, al fine di evitare l'inutile esposizione di un donatore sano al G-CSF.

Nel contesto della mobilizzazione delle HSC, riceveranno per 5 giorni iniezioni sottocutanee di G-CSF alla dose di 10 µg/kg di peso corporeo.

4.1.1 Raccolta di cellule mononucleari mediante citaferesi

Caratteristiche del materiale di partenza:

Le cellule staminali ematopoietiche del sangue periferico non saranno prelevate per la produzione di globuli rossi in coltura a meno che l'innesto destinato al paziente non contenga > 7x106 cellule CD34+/kg di peso corporeo del paziente ricevente, la dose cellulare stabilita in letteratura sia sufficiente per ricostituire l'ematopoiesi di un paziente che riceve un innesto allogenico. In questo modo il protocollo di ricerca non comporterà alcuna perdita di possibilità per il paziente.

4.1.2 Isolamento di cellule CD34+ per il protocollo Le cellule CD34+ da utilizzare per la ricerca saranno selezionate su una colonna di selezione immunomagnetica positiva utilizzando un sistema Isolex®. Per il buon funzionamento del sistema è necessario un minimo di 45x106 celle CD34+. Questi fattori limitanti ci obbligano ad utilizzare come materiale di partenza cellule staminali mobilizzate con G-CSF. Dopo la rimozione di questo campione per lo studio, l'innesto dovrà contenere un minimo di 7x106 cellule CD34+/kg di peso corporeo del paziente.

Il materiale di partenza post-selezione sarà costituito da cellule CD34+ di grado clinico purificate mediante selezione immunomagnetica. Dopo la selezione immunomagnetica dovrebbe essere ottenuta una purezza superiore al 50% delle cellule CD34+. La percentuale di cellule vitali sarà determinata mediante colorazione con tripan blue. Le cellule CD34+ purificate saranno congelate in una soluzione di albumina al 4% contenente il 10% di DMSO e condizionate in criotubi da 2.5 mL contenenti 1x106 cellule CD34+. Dopo lo scongelamento, la vitalità cellulare dovrebbe essere superiore al 50%.

È necessario un minimo di 1 milione di cellule CD34+ vitali per la semina in coltura il giorno 0.

4.1.3 Caratterizzazione biologica del cRBC

Il principio attivo è il cRBC filtrato e il prodotto finale cRBC è marcato con 51Cr. Poiché il prodotto deve essere reiniettato subito dopo l'etichettatura, la caratterizzazione sarà effettuata sul principio attivo e coinvolgerà i seguenti elementi:

Il principio attivo dovrebbe essere costituito da:

1. RBC caratterizzato da:

   • la loro morfologia (su vetrini colorati con May-Grunwald-Giemsa),
   • il loro contenuto di emoglobina (MHC > 25 pg misurato in un sistema automatico Sysmex XE-2100) (vedere 3.2.S.4.3);
2. eritroblasti acidofili < 1,2% (in > 10.000 cellule contate su un vetrino);
3. ad esclusione di tutti gli altri tipi di cellule in > 10.000 cellule contate su un vetrino.

4.1.4 Criteri sufficienti del principio attivo (cRBC)

Il prodotto sarà etichettato con cromo se presenta le seguenti caratteristiche:

• da 5 a 10x109 RBC con MHC > 25 pg,
• < 1,2% di eritroblasti acidofili,
• un'assenza di leucociti. I restanti controlli microbiologici saranno noti a posteriori.

4.1.5 Etichettatura con cromo 51

Questo passaggio verrà eseguito nella clinica di medicina nucleare. L'etichettatura viene eseguita:

• utilizzando una sospensione di cRBC,
• e una soluzione sterile di [51Cr] cromato di sodio avente un'attività di 37 MBq/mL alla calibrazione.

La stessa procedura di etichettatura viene eseguita in condizioni clinicamente sterili. La sospensione viene iniettata in frazioni da 0,3 mL (vincolo legato alla misurazione dell'attività 51Cr delle siringhe prima dell'iniezione) utilizzando siringhe da 2 mL chiuse con tappo. Il volume massimo reiniettato sarà di 5 ml per via endovenosa.

4.1.6 Criteri sufficienti del prodotto finale etichettato con 51Cr

Il prodotto marcato verrà iniettato nel volontario sano se presenta le seguenti caratteristiche:

• Attività 51Cr tra 2.500 KBq (minimo) e 5.000 KBq (massimo),
• un'assenza di 51Cr non legato alle cellule.

4.1.7 Iniezione nei riceventi Questa fase avverrà entro 2 mesi dalla raccolta delle cellule staminali. Iniezione endovenosa diretta di cRBC marcati in un volume di 1 mL, in una stanza riservata alla somministrazione di farmaci radioattivi, situata nell'ambulatorio di medicina nucleare e adiacente al laboratorio di preparazione, per motivi normativi.

Mantenimento di un percorso venoso fino alla fine del periodo di sorveglianza. Prelievo di 2 campioni di 10 mL di sangue in EDTA mediante puntura venosa all'ansa del gomito, a T+1h e T+3h dopo l'iniezione.

Criteri per la dimissione dalla clinica: assenza di febbre o brividi, pressione arteriosa normale ed esame clinico normale.

Durata totale della sorveglianza post-iniezione: 4 ore.

4.2 Pianificazione degli appuntamenti per la misurazione della durata della vita dei cRB La raccolta di campioni da 10 mL mediante puntura venosa all'ansa del gomito e il follow-up dei riceventi saranno effettuati presso il CIC St Antoine.

Trasferimento dei tubi alla clinica di medicina nucleare.

• Il terzo campione verrà prelevato T+24h dopo l'iniezione.
• I successivi 3 verranno prelevati in giorni scelti in base al decadimento stimato dai primi prelievi (tra T+48h e T+30 giorni dopo l'iniezione).

La mancanza di fissazione di date fisse di campionamento è giustificata dalla necessità di adattarsi alla cinetica di questa popolazione omogenea di cRBC, attualmente sconosciuta.

Ad ogni appuntamento verrà effettuato un esame clinico. Dopo aver eseguito le misurazioni, i campioni verranno distrutti.

In conclusione, questo approccio presenta diversi vantaggi:

1. Evita di iniettare un fattore di crescita, G-CSF, in un volontario sano per i soli obiettivi dello studio.
2. La situazione autologa evita ogni rischio immunologico e ogni rischio di trasmissione di agenti infettivi.
3. 51Cr è un emettitore di radiazioni gamma di energia 320 keV e ha un periodo radioattivo di 27,7 giorni. L'irradiazione risultante da questo studio non comporta alcun rischio misurabile. Non è necessario prevedere particolari precauzioni radioprotettive, né per il ricevente né per chi è a contatto con esso.