Viljellyt punasolut: elinikä in vivo -tutkimus (GRc2008)

1. YLEISTÄ

   1.1 cRBC:n kliininen tuotanto Tässä tutkimuksessa cRBC on sekä aktiivinen ainesosa että lopputuote, jolle on tehty radioaktiivinen kromileimaus.

   Uudelleen ruiskutettavan 5x109 cRBC:n määrä määräytyy sen mukaan, että radioaktiivisuusmäärän on oltava välillä 2500 - 5000 kBq, jotta riittävä herkkyys mittaamaan elinikää.

   1.2 Testattu hypoteesi Koska cRBC-soluilla on in vitro kaikki alkuperäisen punasolun toiminnalliset ominaisuudet, oletetaan, että ne ovat eläviä in vivo.

   Tämä elinkelpoisuus arvioidaan mittaamalla niiden elinikä. Sitä verrataan alkuperäisen punasolun raportoituun elinikään, eli 30+3 päivää.

2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

   2.1 Päätavoite Viljeltyjen punasolujen eliniän in vivo tutkimus.

   2.2 Arviointikriteerit

   2.2.1 Pääasiallinen: Pääkriteeri on cRBC:n mitattu käyttöikä. Sitä verrataan alkuperäisen punasolun raportoituun elinikään, eli 30+3 päivää.

   Tutkimukseen sisältyy cRBC-kohortin leimaus: antamisen jälkeen tämä cRBC-kohortti vanhenee kiertävässä veressä ja katoaa sitten "elinkaarinsa" lopussa. Tulokset tulkitaan seuraavasti:

   - jos kolmen ensimmäisen verinäytteen radioaktiivisuus pysyy vakiona (hajoamisen korjaamisen jälkeen), tämä katsotaan todisteeksi ennenaikaisen solutuhon puuttumisen puolesta.

   Seuraavat 3 näytettä otetaan myöhemmin [30 päivän sisällä, jonka jälkeen näytteiden radioaktiivisuuden mittaus ei ole enää mahdollista kromi 51:n hajoamisen, kromin eliminoitumisen soluista nopeudella 1,2 % vuoksi. vuorokaudessa ja radioaktiivisten aineiden määrän tarkkuuden puute erittäin alhaisissa toiminnoissa]. Voidaan päätellä, että cRBC: n elinikä on yli 33 päivää.

   - jos kolmessa ensimmäisessä näytteessä radioaktiivisuus vähenee merkittävästi ja aikaisemmin kuin vertailukäyrillä, kolme muuta läheltä otettua näytettä mahdollistavat cRBC:n keskimääräisen eliniän arvioinnin.

3. KOKEELLINEN SUUNNITELMA

   3.1 Tutkimustyyppi Kliininen toteutettavuusmääritys.

   3.2 Kokeilusuunnitelma

   Tutkimus toteutetaan 4 vaiheessa:

   1. tuottaa in vitro 1 ml verta, eli 5 x 109 enukleaarista punasolua, mononukleaarisista soluista, jotka on eristetty terveeltä hyväntahtoiselta luovuttajalta saadusta HSC-siirteestä,
   2. näiden cRBC:n leimaus 51Cr:llä punasolujen eliniän tutkimiseen käytetyn klassisen protokollan mukaisesti,
   3. autologisen cRBC:n uudelleeninjektio samaan luovuttajaan,
   4. vastaanottajan seuranta enintään 33 päivän ajan injektoitujen solujen puoliintumisajan mittaamiseksi.
4. VASTAAJIEN OMINAISUUDET 4.1 Tutkimuspopulaation kuvaus Valinta suorittaa tutkimus terveillä vapaaehtoisilla eikä potilailla perustuu tarpeeseen saada terve fysiologinen konteksti välttäen kaikki tilanteet, jotka voivat johtaa hemolyysiin. Koska protokolla edellyttää mobilisaatiota kasvutekijällä, perifeeristen kantasolujen (PSC) luovuttajat saavat G-CSF:ää.

Vapaaehtoiset vastaanottajat rekrytoidaan PSC:n perheen sisäisten luovuttajien joukosta, jotta terveen luovuttajan tarpeeton altistuminen G-CSF:lle voidaan välttää.

HSC:n mobilisoinnin yhteydessä he saavat 5 päivän ajan ihonalaisia ​​G-CSF-injektioita annoksella 10 µg/kg ruumiinpainoa.

4.1.1 Mononukleaaristen solujen kerääminen sytafereesillä

Lähtöaineen ominaisuudet:

Perifeerisen veren hematopoieettisia kantasoluja ei oteta viljeltyjen punasolujen tuotantoon, ellei potilaalle tarkoitettu siirre sisällä > 7x106 CD34+-solua/kg potilaan vastaanottajaa, jolloin kirjallisuudessa vahvistettu soluannos on riittävä hematopoieesin palauttamiseen potilaan, joka saa allogeenisen siirteen. Siten tutkimusprotokolla ei aiheuta potilaalle mahdollisuuden menetystä.

4.1.2 CD34+-solujen eristäminen protokollaa varten Tutkimukseen käytettävät CD34+-solut valitaan positiiviseen immunomagneettiseen valintapylvääseen Isolex®-järjestelmää käyttäen. Vähintään 45x106 CD34+-solua tarvitaan järjestelmän moitteettoman toiminnan kannalta. Nämä rajoittavat tekijät pakottavat meidät käyttämään lähtöaineena G-CSF:llä mobilisoituja kantasoluja. Kun tämä näyte on poistettu tutkimusta varten, siirteen tulee sisältää vähintään 7 x 106 CD34+-solua/kg potilaan ruumiinpainoa.

Jälkivalinnan lähtöaine koostuu kliinisistä CD34+-soluista, jotka on puhdistettu immunomagneettisella valinnalla. Yli 50 % CD34+-solujen puhtaus tulisi saada immunomagneettisen valinnan jälkeen. Elävien solujen prosenttiosuus määritetään värjäämällä trypaanisinisellä. Puhdistetut CD34+-solut jäädytetään 4-prosenttisessa albumiiniliuoksessa, joka sisältää 10 % DMSO:ta, ja niitä käsitellään 2,5 ml:n kryoputkissa, jotka sisältävät 1 x 106 CD34+-solua. Sulatuksen jälkeen solujen elinkelpoisuuden tulisi olla yli 50 %.

Vähintään 1 miljoona elinkelpoista CD34+-solua tarvitaan kylvämiseen viljelmään päivänä 0.

4.1.3 cRBC:n biologinen karakterisointi

Aktiivinen ainesosa on suodatettu cRBC ja lopputuote cRBC, joka on merkitty 51Cr:llä. Koska tuote on injektoitava uudelleen välittömästi merkinnän jälkeen, vaikuttavalle aineelle tehdään karakterisointi ja se sisältää seuraavat osatekijät:

Aktiivisen periaatteen tulisi koostua:

1. RBC:lle ominaista:

   • niiden morfologia (levyillä, jotka on värjätty May-Grunwald-Giemsalla),
   • niiden hemoglobiinipitoisuus (MHC > 25 pg Sysmex XE-2100 -automaatilla mitattuna) (katso 3.2.S.4.3);
2. asidofiiliset erytroblastit < 1,2 % (> 10 000 solussa laskettuna objektilasilta);
3. sulkematta pois kaikki muut solutyypit > 10 000 solussa laskettuna objektilasille.

4.1.4 Aktiivisen aineen (cRBC) riittävät kriteerit

Tuote merkitään kromilla, jos sillä on seuraavat ominaisuudet:

• 5–10 x 109 punasolua, MHC > 25 pg,
• < 1,2 % asidofiilisiä erytroblasteja,
• leukosyyttien puuttuminen. Loput mikrobiologiset kontrollit tunnetaan jälkikäteen.

4.1.5 Merkintä kromilla 51

Tämä vaihe suoritetaan isotooppilääketieteen klinikalla. Merkintä suoritetaan:

• käyttämällä cRBC-suspensiota,
• ja steriili [51Cr]-natriumkromaattiliuos, jonka aktiivisuus on 37 MBq/ml kalibroitaessa.

Itse merkintämenettely suoritetaan kliinisesti steriileissä olosuhteissa. Suspensio injektoidaan 0,3 ml:n fraktioina (rajoitus liittyy ruiskujen 51Cr-aktiivisuuden mittaamiseen ennen injektiota) käyttämällä 2 ml:n ruiskuja, jotka on suljettu tulpalla. Suurin uudelleeninjektoitu tilavuus on 5 ml suonensisäisellä reitillä.

4.1.6 Riittävät kriteerit lopputuotteelle, joka on merkitty 51Cr:llä

Merkitty tuote ruiskutetaan terveelle vapaaehtoiselle, jos sillä on seuraavat ominaisuudet:

• 51Cr-aktiivisuus välillä 2 500 KBq (vähintään) ja 5 000 KBq (maksimi),
• soluihin sitoutumattoman 51Cr:n puuttuminen.

4.1.7 Injektio vastaanottimiin Tämä vaihe suoritetaan 2 kuukauden kuluessa kantasolujen keräämisestä. Leimatun cRBC:n suora suonensisäinen injektio 1 ml:n tilavuudessa radioaktiivisten lääkkeiden antamiseen varattuun tilaan, joka sijaitsee isotooppilääketieteen klinikalla ja valmistuslaboratorion vieressä, sääntelysyistä.

Laskimoreitin ylläpito valvontajakson loppuun asti. Kerätään 2 näytettä 10 ml verta EDTA:han laskimopunktiolla kyynärpään mutkassa, T+1 h ja T+3 h injektion jälkeen.

Klinikalta kotiutuksen kriteerit: kuumeen tai vilunväristyksen puuttuminen, normaali verenpaine ja normaali kliininen tutkimus.

Injektion jälkeisen valvonnan kokonaiskesto: 4 tuntia.

4.2 Aikataulujen suunnittelu cRBC:n eliniän mittaamiseksi. 10 ml:n näytteiden keräys laskimopunktiolla kyynärpään mutkassa ja vastaanottimien seuranta suoritetaan CIC St Antoinen tiloissa.

Putkien siirto isotooppilääketieteen klinikalle.

• Kolmas näyte otetaan T+24 h injektion jälkeen.
• Seuraavat 3 otetaan päivinä, jotka valitaan ensimmäisistä näytteistä arvioidun hajoamisen mukaan (välillä T+48h ja T+30 päivää injektion jälkeen).

Kiinteiden näytteenottopäivien vahvistamisen puute on perusteltua tarpeella mukautua tämän homogeenisen cRBC-populaation kinetiikkaan, jota tällä hetkellä ei tunneta.

Jokaisella vastaanotolla tehdään kliininen tutkimus. Mittausten suorittamisen jälkeen näytteet tuhotaan.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tällä lähestymistavalla on useita etuja:

1. Se välttää kasvutekijän, G-CSF:n, injektoinnin terveeseen vapaaehtoiseen tutkimuksen ainoan tarkoituksen vuoksi.
2. Autologinen tilanne välttää immunologisen riskin ja tartunnanaiheuttajien leviämisen riskin.
3. 51Cr on 320 keV:n energian gammasäteilyn emitteri ja sen radioaktiivinen jakso on 27,7 päivää. Tästä tutkimuksesta saatuun säteilytykseen ei liity mitattavissa olevaa riskiä. Mitään erityisiä säteilysuojatoimenpiteitä ei tarvitse suunnitella vastaanottajalle tai hänen kanssaan kosketuksissa oleville.