関節リウマチ患者におけるインフルエンザに対するワクチン接種に対する細胞免疫応答

60 人の RA 患者と 30 人の健康な年齢のマッチしたコントロールが研究に参加します。

インフォームド コンセントに署名した後、すべての被験者は、来年の秋に WHO によって推奨される不活化スプリット ビリオン ワクチンを接種されます。

患者は 0 週目と 6 週後に評価されます。 臨床評価は、疾患活動性スコア 28 (DAS 28) に基づいて行われます。これには、腫れた関節や圧痛のある関節の数、医師の視覚的総合評価、ワクチン接種当日および 6 週間後に採取された ESR および CRP 血液が含まれます。

末梢血単核細胞の調製 血液サンプルは、ワクチン接種の前およびワクチン接種の 4 週間後に取得されます。 末梢血単核細胞 (PBMC) は、Lymphoprep 勾配 (Ny​​comed、オスロ、ノルウェー) でのヘパリン化血液の遠心分離によって分離されます。 細胞を組織培養培地 RPMI (RPMI1640-Hepes with Glutamax-I、GIBCO BRL、NY、USA) で 2 回洗浄し、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS ) (GIBCO BRL、ニューヨーク、米国)。

ELISPOT アッセイ 96 ウェル PVDF (二フッ化ポリビニリデン、Millipore Corp.、MA、USA) プレートを 70% EtOH であらかじめ湿らせ、100 μl/ウェルの抗ヒト IFN-モノクローナル抗体 (mAb) 1-D1K でコーティングします。無菌濾過リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１５μｇ／ｍｌに希釈した。 プレートを4℃で一晩保存します。 合計 100,000 PBMC と 5 μl/ウェル (1 g/ml) のペプチドを、各条件について 2 つずつ各ウェルに加え、5% CO2 中、37°C​​ で 24 時間インキュベートします。 インキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＢＳを含む濾過ＰＢＳで濃度１μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化ｍＡｂ（７－Ｂ６－１－ビオチン、Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）１００μｌを各ウェルに加えた。 プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１～１０００倍に希釈したストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）１００μｌ／ウェルと共に室温で１時間インキュベートする。 洗浄後、100 μl/ウェルの比色基質 (BCIP/NBT-plus、Mabtech AB) を加えて細胞を発色させ、ELISPOT リーダーで計数します。 各スポットは、単一の IFN 分泌 T 細胞スポット形成細胞 (SFC) によって生成されました。 すべてのテストは重複して実行され、平均値が計算されました。 バックグラウンド (ペプチド刺激なしのウェル) を差し引いた後、ペプチド刺激細胞を含むウェルのスポット数がバックグラウンド スポット数の少なくとも 2 倍になる場合、反応は陽性であると見なされます14。 20/106 SFCより。

フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン産生の検出 細胞内染色法は、ペプチド刺激によって活性化された INF 産生 T 細胞の表現型を識別するために使用されます。 Rauser et al.15 PBMC が 1 g/ml のインフルエンザ ペプチドで 6 時間刺激されたプロトコルを使用して、染色が行われます。 インキュベーションの最後の 4 時間に、ブレフェルジン A (10 g/ml、Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス) を添加します。 陽性対照は、細胞を 0.5 g/ml PMA (ホルボール 12-ミレステ 13-アセテート) および 1 g/ml イオノマイシン (両方とも Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で刺激することによって得られます。 細胞を透過処理し、蛍光色素標識抗 CD3、抗 CD4 または抗 CD8 および抗 IFN-抗体 (Becton Dickinson、San Jose、CA、USA) で染色します。 ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによってサンプルを分析する。 このテストの陽性限界は、IFN 産生 T 細胞の 0.05% でした。

特定の CD4+ および CD8+ の増殖 細胞応答は、ワクチンに存在する 3 つのウイルス株の抗原による刺激と、同じ細胞による活性化 Th1 サイトカインの産生による特定の T CD4+ および CD8+ リンパ球の増殖を同時に分析することによって評価されます。

簡単に言えば、インフルエンザ特異的 T 細胞による増殖とサイトカイン産生を同時に分析するために、末梢血単核細胞を各ドナーから T0 と T1 で取得し、蛍光核色素カルボキシフルオレセイン スクシンイミジル エステル (CFSE; Molecular Probes) で染色し、重複して培養します。研究で使用されたインフルエンザウイルスワクチンに含まれるウイルス株のそれぞれからのHAのペプチドまたは72時間の対照ペプチドの存在。 インキュベーションの最後に、ブレフェルジンで培養を停止し、細胞を再懸濁し、蛍光色素結合抗 CD8 および抗インターフェロン-γ (IFN-γ) モノクローナル抗体 (Becton & Dickinson) で染色し、6 色フローサイトメーターで分析します。 (FACSCanto-Becton&Dickinson)およびFACS DIVAソフトウェア。 細胞分裂ごとに核蛍光が半分になるため、増殖中の細胞はサイトグラムの左側の象限に収まり、分裂が増えるほど蛍光は少なくなります。 IFN-γ 産生細胞は、サイトグラムの上部象限に位置します。 特定のインフルエンザ ペプチドまたはコントロール ペプチドの刺激によって増殖し、IFN-γ (Th1 サイトカイン) を積極的に産生する細胞は、サイトグラムの左上の象限に位置します。 それらは、頻度として測定された(増殖細胞およびIFN-γ産生細胞/全T CD4+またはCD8+リンパ球)。

赤血球凝集阻害試験 ワクチンの免疫原性は、赤血球凝集阻害（HI）試験によって試験された。

インフルエンザ ウイルスには、ヘマグルチニン (HA) とノイラミニダーゼ (NA) という 2 つの重要な表面糖タンパク質があります。 インフルエンザ ウイルスの抗原分類とサブタイピングは、これら 2 つの糖タンパク質に基づいています。 HA は、特定の種の赤血球にも見られる細胞表面受容体に結合することにより、ウイルス細胞の侵入に重要な役割を果たします。 赤血球に結合すると血球凝集が起こり、チューブまたはマイクロタイターウェルの底に凝集した赤血球のカーペットとして観察できます。 HI テストでは、ウイルスのヘマグルチニンに対する抗体が、ウイルスが血液細胞に結合するのをブロックし、赤血球凝集反応を阻害します。

予防接種前後の HI 抗体は、標準的な WHO 手順 16 に従って HI テストを使用して、イスラエル保健省の中央ウイルス学研究所でテストされました。 血清を分離し、コードをラベル付けして、試験まで-20°Cで保存しました。 血清を受容体破壊酵素コレラろ液で処理して非特異的阻害剤を除去し、七面鳥赤血球で非特異的凝集素を除去しました。 処理された血清は、ワクチンに含まれる 3 つの抗原に対する HI テストによってテストされました: A/カリフォルニア (CAL)、B/上海 (SHAN)、および A/ニューカレドニア (NC)。 各抗原の作業希釈 (テスト用量) には、25 μl の抗原に 4 つのヘマグルチニン単位が含まれていました。 試験用量をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、抗血清の段階希釈に加えた。 ヘマグルチニン阻害力価は、赤血球の赤血球凝集を完全に阻害する血清の最高希釈として決定されました。

阻害を示さない抗血清の力価は＜１０と記録された。 体液性応答は、力価の 4 倍以上の上昇、またはワクチン接種の 4 週間後の HI 抗体の非防御ベースラインレベルの <1/40 から 1/40 への上昇のいずれかとして定義されました 17,18。 グループ全体の免疫を評価するために、抗体の幾何平均力価を計算した。

研究の主要評価項目 : 関節リウマチ患者および対照群におけるインターフェロン ガンマを産生する細胞の割合 二次評価項目 : ワクチンの安全性