Risposta dell'immunità cellulare alla vaccinazione contro l'influenza nei pazienti con artrite reumatoide

Parteciperanno allo studio sessanta pazienti con AR e 30 controlli sani di pari età.

Dopo aver firmato il consenso informato, tutti i soggetti saranno vaccinati con il vaccino a virione frazionato inattivato che sarà raccomandato dall'OMS il prossimo autunno.

I pazienti saranno valutati a weel 0 e 6 settimane dopo. La valutazione clinica si baserà sul punteggio di attività della malattia 28 (DAS 28) che include il numero di articolazioni gonfie e doloranti, la valutazione visiva globale del medico, la VES e il sangue CRP da raccogliere il giorno della vaccinazione e 6 settimane dopo.

Preparazione delle cellule mononucleari del sangue periferico I campioni di sangue saranno prelevati prima e 4 settimane dopo la vaccinazione. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) saranno isolate mediante centrifugazione di sangue eparinizzato su gradiente Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norvegia). Le cellule saranno lavate due volte nel mezzo di coltura tissutale RPMI (RPMI1640-Hepes con Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) e risospese ad una concentrazione di 2 106/ml in RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS ) (GIBCO BRL, NY, USA).

Saggio ELISPOT Le piastre da 96 pozzetti in PVDF (difluoruro di polivinilidene, Millipore Corp., MA, USA) saranno prebagnate con EtOH al 70%, quindi rivestite con 100 l/pozzetto di anticorpo monoclonale anti-IFN umano (mAb) 1-D1K , diluito a 15 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato sterile filtrata (PBS). Le piastre saranno mantenute per una notte a 4°C. Un totale di 100.000 PBMC più 5 l/pozzetto (1 g/ml) di peptidi saranno aggiunti a ciascun pozzetto in duplicato per ciascuna condizione e incubati per 24 ore a 37°C in 5% CO2. Dopo l'incubazione le piastre saranno lavate con PBS quindi ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 l di mAb biotinilato (7-B6-1-biotina, Mabtech AB), diluito in PBS filtrato con 0.5% FBS alla concentrazione di 1 g/ml. Le piastre saranno incubate 2 ore a temperatura ambiente, lavate con PBS e quindi incubate con 100 l/pozzetto di streptavidina-fosfatasi alcalina (Mabtech AB) diluito 1-1000 in PBS con 0.5% FBS per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, le cellule saranno sviluppate aggiungendo 100 l/pozzetto di substrato colorimetrico (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) e poi contate in un lettore ELISPOT. Ciascuno spot è stato prodotto da una singola cellula formante spot (SFC) che secerne IFN. Tutti i test sono stati eseguiti in duplicato e sono stati calcolati i valori medi. Una risposta sarà considerata positiva quando il numero di spot nei pozzetti con cellule stimolate da peptidi, dopo la sottrazione del background (pozzetti senza stimolazione peptidica), sarà almeno due volte maggiore del numero di spot di background14 e più di 20/106 SFC.

Determinazione della produzione di citochine intracellulari mediante citometria a flusso Il metodo di colorazione intracellulare sarà utilizzato per identificare il fenotipo delle cellule T produttrici di INF attivate dalla stimolazione peptidica. La colorazione verrà eseguita utilizzando il protocollo descritto da Rauser et al.15 Le PBMC sono state stimolate per 6 h con 1 g/ml di peptidi influenzali. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) verrà aggiunto per le ultime 4 ore di incubazione. Un controllo positivo sarà ottenuto stimolando le cellule con 0.5 g/ml di PMA (Phorbol 12-myrestate 13-acetate) e 1 g/ml di ionomicina (entrambe da Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Le cellule saranno permeabilizzate e colorate con anticorpi anti-CD3, anti-CD4 o anti-CD8 e anti-IFN marcati con fluorocromi (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). I campioni saranno analizzati mediante citometria a flusso utilizzando FACSCalibur (Becton Dickinson). Il limite positivo per questo test era dello 0,05% di cellule T che producono IFN.

Proliferazione di specifici CD4+ e CD8+ La risposta cellulare sarà valutata analizzando simultaneamente la proliferazione di specifici linfociti T CD4+ e CD8+ dopo stimolazione con antigeni dei tre ceppi virali presenti nel vaccino e produzione di citochine Th1 di attivazione da parte delle stesse cellule.

In breve, per analizzare simultaneamente la proliferazione e la produzione di citochine da parte delle cellule T specifiche dell'influenza, cellule mononucleate del sangue periferico saranno ottenute a T0 e T1 da ciascun donatore, colorate con il colorante nucleare fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE; Molecular Probes) e coltivate in duplicato in la presenza di peptidi di HA da ciascuno dei ceppi virali contenuti nel vaccino contro il virus dell'influenza utilizzato nello studio o nel peptide di controllo per 72 ore. Al termine dell'incubazione le colture saranno fermate con brefeldina, le cellule risospese, colorate con anticorpi monoclonali anti-CD8 coniugati con fluorocromo e anti-interferone-γ (IFN-γ) (Becton&Dickinson) e analizzate mediante un citometro a flusso a sei colori (FACSCanto-Becton&Dickinson) e software FACS DIVA . Poiché ad ogni divisione cellulare la fluorescenza nucleare è dimezzata, le cellule proliferanti cadono nei quadranti di sinistra del citogramma, maggiore è la divisione minore è la fluorescenza. Le cellule che producono IFN-γ cadono nei quadranti superiori dei citogrammi. Le cellule che in seguito alla stimolazione del peptide influenzale specifico o del peptide di controllo proliferano e producono attivamente IFN-γ (citochina Th1) cadono nel quadrante superiore sinistro del citogramma. Sono stati misurati come frequenza (cellule in proliferazione e produttrici di IFN-γ/linfociti T CD4+ o CD8+ totali).

Test di inibizione dell'emoagglutinazione L'immunogenicità del vaccino è stata testata mediante il test di inibizione dell'emoagglutinazione (HI).

Il virus dell'influenza ha due importanti glicoproteine ​​di superficie: l'emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA). La classificazione antigenica e la sottotipizzazione dei virus influenzali si basano su queste due glicoproteine. L'HA svolge un ruolo chiave nell'ingresso delle cellule virali legandosi ai recettori della superficie cellulare, che si trovano anche sui globuli rossi di alcune specie. Il legame con i globuli rossi determina l'emoagglutinazione, che può essere osservata come un tappeto di globuli rossi agglutinati sul fondo di una provetta o di un pozzetto di microtitolazione. Nel test HI, gli anticorpi diretti contro le emoagglutinine virali impediscono al virus di legarsi alle cellule del sangue e quindi inibiscono la reazione di emoagglutinazione.

Gli anticorpi HI pre e post immunizzazione sono stati testati presso il Laboratorio Centrale di Virologia del Ministero della Salute israeliano utilizzando il test HI secondo una procedura standard dell'OMS 16. I sieri sono stati separati, etichettati con codice e conservati a -20°C fino al momento del test. I sieri sono stati trattati con l'enzima distruttivo del colera filtrato del recettore per rimuovere gli inibitori non specifici e con i globuli rossi di tacchino per rimuovere le agglutinine non specifiche. I sieri trattati sono stati testati mediante HI test contro i tre antigeni inclusi nel vaccino: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) e A/Nuova Caledonia (NC). La diluizione di lavoro (dose di prova) di ciascun antigene conteneva quattro unità di emoagglutinina in 25 µl di antigene. Le dosi di prova sono state diluite in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aggiunte alla diluizione seriale dell'antisiero. Il titolo di inibizione dell'emoagglutinina è stato determinato come la massima diluizione del siero che inibisce completamente l'emoagglutinazione dei globuli rossi.

Il titolo di un antisiero che non mostrava alcuna inibizione è stato registrato come <10. La risposta umorale è stata definita come un aumento quadruplo o superiore del titolo o un aumento da un livello basale non protettivo di <1/40 a 1/40 di anticorpi HI quattro settimane dopo la vaccinazione 17,18. I titoli anticorpali medi geometrici sono stati calcolati per valutare l'immunità dell'intero gruppo.

Endpoint primario dello studio: la percentuale di cellule che producono interferone gamma nei pazienti con artrite reumatoide e nei controlli Endpoint secondario: sicurezza del vaccino