Ответ клеточного иммунитета на вакцинацию против гриппа у больных ревматоидным артритом

В исследовании примут участие 60 пациентов с РА и 30 здоровых лиц соответствующего возраста.

После подписания информированного согласия все субъекты будут вакцинированы инактивированной сплит-вирионной вакциной, которая будет рекомендована ВОЗ следующей осенью.

Пациенты будут оцениваться на 0-й неделе и через 6 недель. Клиническая оценка будет основываться на шкале активности заболевания 28 (DAS 28), которая включает количество опухших и болезненных суставов, визуальную общую оценку врача, СОЭ и СРБ. Кровь берут в день вакцинации и через 6 недель.

Подготовка мононуклеарных клеток периферической крови Образцы крови будут получены до и через 4 недели после вакцинации. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) будут выделены центрифугированием гепаринизированной крови в градиенте Lymphoprep (Nycomed, Осло, Норвегия). Клетки дважды промывают в среде для тканевых культур RPMI (RPMI1640-Hepes с Glutamax-I, GIBCO BRL, Нью-Йорк, США) и ресуспендируют до концентрации 2 106/мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием (FBS). ) (GIBCO BRL, Нью-Йорк, США).

Анализ ELISPOT. 96-луночные планшеты PVDF (поливинилидендифторид, Millipore Corp., Массачусетс, США) предварительно увлажняют 70% EtOH, затем покрывают 100 мкл/лунку моноклонального антитела против человеческого IFN- (mAb) 1-D1K, разводят до концентрации 15 мкг/мл в стерильном отфильтрованном фосфатно-солевом буфере (PBS). Планшеты оставляют на ночь при 4°C. Всего 100 000 РВМС плюс 5 мкл/лунку (1 мкг/мл) пептидов будут добавлены в каждую лунку в двух повторностях для каждого условия и инкубированы в течение 24 часов при 37°C в 5% CO2. После инкубации планшеты промывали PBS, затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл биотинилированных mAb (7-B6-1-биотин, Mabtech AB), разведенных в отфильтрованном PBS с 0,5% FBS до концентрации 1 мкг/мл. Планшеты инкубируют 2 часа при комнатной температуре, промывают PBS и затем инкубируют со 100 мкл/лунку стрептавидин-щелочной фосфатазы (Mabtech AB), разбавленной 1-1000 в PBS с 0,5% FBS, в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки клетки проявляют добавлением 100 мкл/лунку колориметрического субстрата (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) и затем подсчитывают в ридере ELISPOT. Каждое пятно продуцировалось одной Т-клеткой, образующей пятна (SFC), секретирующей IFN. Все тесты проводились в двух повторностях и рассчитывались средние значения. Положительным считается ответ, когда количество пятен в лунках с пептид-стимулированными клетками после вычитания фона (лунки без пептидной стимуляции) будет не менее чем в 2 раза превышать количество фоновых пятен14 и более. чем 20/106 SFC.

Обнаружение продукции внутриклеточных цитокинов с помощью проточной цитометрии. Метод внутриклеточного окрашивания будет использоваться для идентификации фенотипа INF-продуцирующих Т-клеток, активированных пептидной стимуляцией. Окрашивание будет выполняться с использованием протокола, описанного Rauser et al.15 PBMC стимулировали в течение 6 часов с помощью 1 мкг/мл пептидов гриппа. Брефельдин А (10 г/мл, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) добавляют в течение последних 4 часов инкубации. Положительный контроль получают путем стимуляции клеток 0,5 мкг/мл ФМА (форбол 12-мирестат 13-ацетат) и 1 мкг/мл иономицина (оба от Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Клетки будут пермеабилизированы и окрашены меченными флуорохромом анти-CD3, анти-CD4 или анти-CD8 и анти-IFN-антителами (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). Образцы будут проанализированы с помощью проточной цитометрии с использованием FACSCalibur (Becton Dickinson). Положительный предел для этого теста составлял 0,05% Т-клеток, продуцирующих IFN.

Пролиферацию специфического CD4+ и CD8+ клеточного ответа будут оценивать путем одновременного анализа пролиферации специфических Т-CD4+ и CD8+-лимфоцитов при стимуляции антигенами трех вирусных штаммов, присутствующих в вакцине, и продукции цитокинов активации Th1 теми же клетками.

Вкратце, для одновременного анализа пролиферации и продукции цитокинов гриппозно-специфическими Т-клетками мононуклеарные клетки периферической крови будут получены в Т0 и Т1 от каждого донора, окрашены флуоресцентным ядерным красителем карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловым эфиром (CFSE; Molecular Probes) и культивированы в двух повторностях в наличие пептидов НА от каждого из штаммов вируса, содержащихся в вакцине против вируса гриппа, используемой в исследовании, или контрольного пептида в течение 72 ч. В конце инкубации культуры останавливают брефельдином, клетки ресуспендируют, окрашивают моноклональными антителами против CD8 и интерферона-γ (IFN-γ), конъюгированными с флуорохромом (Becton&Dickinson), и анализируют с помощью шестицветного проточного цитометра. (FACSCanto-Becton&Dickinson) и программное обеспечение FACS DIVA. Так как при каждом клеточном делении флуоресценция ядер уменьшается вдвое, пролиферирующие клетки попадают в левые квадранты цитограммы, чем больше делений, тем меньше флуоресценция. Клетки, продуцирующие IFN-γ, попадают в верхние квадранты цитограмм. Клетки, которые при стимуляции специфическим пептидом гриппа или контрольным пептидом пролиферируют и активно продуцируют IFN-γ (цитокин Th1), попадают в верхний левый квадрант цитограммы. Их измеряли как частоту (пролиферирующие и IFN-γ-продуцирующие клетки/общее количество Т CD4+ или CD8+ лимфоцитов).

Реакция ингибирования гемагглютинации Иммуногенность вакцины тестировали с помощью реакции ингибирования гемагглютинации (HI).

Вирус гриппа имеет два важных поверхностных гликопротеина: гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA). Антигенная классификация и субтипирование вирусов гриппа основаны на этих двух гликопротеинах. ГК играет ключевую роль во проникновении вируса в клетку, связываясь с рецепторами клеточной поверхности, которые также обнаруживаются на эритроцитах некоторых видов. Связывание с эритроцитами приводит к гемагглютинации, которую можно наблюдать в виде ковра из агглютинированных эритроцитов на дне пробирки или лунки микротитрационного аппарата. В тесте HI антитела, направленные против вирусных гемагглютининов, блокируют связывание вируса с клетками крови и, таким образом, ингибируют реакцию гемагглютинации.

Антитела к HI до и после иммунизации были протестированы в Центральной вирусологической лаборатории Министерства здравоохранения Израиля с использованием теста HI в соответствии со стандартной процедурой ВОЗ 16. Сыворотки отделяли, маркировали кодом и хранили при -20°C до тестирования. Сыворотки обрабатывали фильтратом холерного фермента, разрушающего рецепторы, для удаления неспецифических ингибиторов и эритроцитами индейки для удаления неспецифических агглютининов. Обработанные сыворотки тестировали с помощью HI-теста против трех антигенов, включенных в вакцину: A/Калифорния (CAL), B/Шангай (SHAN) и A/Новая Каледония (NC). Рабочее разведение (тестовая доза) каждого антигена содержало четыре гемагглютинина в 25 мкл антигена. Тестовые дозы разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) и добавляли к серийным разведениям антисыворотки. Титр ингибирования гемагглютинации определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором полностью ингибируется гемагглютинация эритроцитов.

Титр антисыворотки, не демонстрирующий никакого ингибирования, регистрировали как <10. Гуморальный ответ определяли либо как четырехкратное или более повышение титра, либо как повышение с незащитного исходного уровня <1/40 до 1/40 HI-антител через четыре недели после вакцинации 17,18. Средние геометрические титры антител рассчитывали для оценки иммунитета всей группы.

Первичная конечная точка исследования: доля клеток, продуцирующих гамма-интерферон, у пациентов с ревматоидным артритом и контрольной группой. Вторичная конечная точка: безопасность вакцины.