Soluimmuniteetin vaste influenssarokotteelle potilailla, joilla on nivelreuma

Tutkimukseen osallistuu 60 nivelreumapotilasta ja 30 tervettä, ikääntynyttä verrokkia.

Tietoisen suostumuksen allekirjoittamisen jälkeen kaikki tutkittavat rokotetaan inaktivoidulla split virion -rokotteella, jota WHO suosittelee ensi syksynä.

Potilaat arvioidaan viikolla 0 ja 6 viikkoa myöhemmin. Kliininen arviointi perustuu Disease Activity Score 28:aan (DAS 28), joka sisältää turvonneiden ja arkojen nivelten määrän, lääkärin visuaalisen kokonaisarvioinnin, ESR- ja CRP-veren, joka on kerättävä rokotuspäivänä ja 6 viikkoa myöhemmin.

Ääreisveren mononukleaarisolujen valmistaminen Verinäytteet otetaan ennen rokotusta ja 4 viikkoa sen jälkeen. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC) eristetään sentrifugoimalla heparinisoitua verta Lymphoprep-gradientilla (Nycomed, Oslo, Norja). Solut pestään kahdesti kudosviljelyelatusaineessa RPMI (RPMI1640-Hepes ja Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) ja suspendoidaan uudelleen pitoisuuteen 2106/ml RPMI 1640:ssä, jota on täydennetty 10 % lämpöinaktivoidulla naudan sikiön seerumilla (FBS). ) (GIBCO BRL, NY, USA).

ELISPOT-määritys 96-kuoppaiset PVDF-levyt (polyvinylideenidifluoridi, Millipore Corp., MA, USA) esikostutetaan 70 % EtOH:lla ja päällystetään sitten 100 litralla/kuoppa anti-ihmis-IFN-monoklonaalista vasta-ainetta (mAb) 1-D1K, laimennettu 15 g/ml steriiliin suodatettuun fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Levyjä pidetään yön yli 4 °C:ssa. Yhteensä 100 000 PBMC:tä plus 5 l/kuoppa (1 g/ml) peptidejä lisätään kuhunkin kuoppaan kahtena rinnakkaisena kutakin tilaa varten ja inkuboidaan 24 tuntia 37 °C:ssa 5 % C02:ssa. Inkuboinnin jälkeen levyt pestään PBS:llä, sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 1 biotinyloitua mAb:tä (7-B6-1-biotiini, Mabtech AB), joka oli laimennettu suodatettuun PBS:ään, jossa oli 0,5 % FBS:ää konsentraatioon 1 g/ml. Levyjä inkuboidaan 2 tuntia huoneenlämpötilassa, pestään PBS:llä ja sitten inkuboidaan 100 l/kuoppa streptavidiini-alkalifosfataasia (Mabtech AB), joka on laimennettu 1-1000 PBS:ään, jossa on 0,5 % FBS:ää, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen solut kehitetään lisäämällä 100 l/kuoppa kolorimetristä substraattia (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) ja lasketaan sitten ELISPOT-lukijassa. Jokaisen täplän tuotti yksi IFN:ää erittävä T-solutäplää muodostava solu (SFC). Kaikki testit suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja keskiarvot laskettiin. Vasteen katsotaan olevan positiivinen, kun täplien määrä kuopissa, joissa on peptidistimuloituja soluja, taustan vähentämisen jälkeen (kuopat ilman peptidistimulaatiota) on vähintään kaksi kertaa suurempi kuin taustapisteiden määrä14 tai enemmän. kuin 20/106 SFC.

Solunsisäisen sytokiinituotannon havaitseminen virtaussytometrialla Solunsisäistä värjäysmenetelmää käytetään peptidistimulaatiolla aktivoitujen INF:ää tuottavien T-solujen fenotyypin tunnistamiseen. Värjäys suoritetaan käyttäen protokollaa, jonka ovat kuvanneet Rauser et al.15. PBMC:itä stimuloitiin 6 tunnin ajan 1 g/ml influenssapeptideillä. Brefeldin A:ta (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) lisätään inkuboinnin viimeisten 4 tunnin ajaksi. Positiivinen kontrolli saadaan stimuloimalla soluja 0,5 g/ml PMA:lla (Phorbol 12-myrestaatti 13-asetaatti) ja 1 g/ml ionomysiinillä (molemmat Sigma-Aldrichilta, St Louis, MO, USA). Solut permeabilisoidaan ja värjätään fluorokromilla leimatuilla anti-CD3-, anti-CD4- tai anti-CD8- ja anti-IFN-vasta-aineilla (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Näytteet analysoidaan virtaussytometrisesti käyttämällä FACSCaliburia (Becton Dickinson). Tämän testin positiivinen raja oli 0,05 % IFN:ää tuottavista T-soluista.

Spesifisen CD4+- ja CD8+-soluvaste arvioidaan analysoimalla samanaikaisesti spesifisten T-CD4+- ja CD8+-lymfosyyttien proliferaatio rokotteessa olevien kolmen viruskannan antigeeneillä stimuloimalla ja samojen solujen aktivoivien Th1-sytokiinien tuottamana.

Lyhyesti, influenssaspesifisten T-solujen proliferaation ja sytokiinituotannon analysoimiseksi samanaikaisesti perifeerisen veren mononukleaarisolut otetaan T0:ssa ja T1:ssä jokaiselta luovuttajalta, värjätään fluoresoivalla ydinväriaineella karboksifluoreseiinisukkinimidyyliesteri (CFSE; Molecular Probes) ja viljellään kahtena rinnakkaisena HA-peptidien läsnäolo kustakin tutkimuksessa käytetyn influenssavirusrokotteen tai kontrollipeptidin sisältämästä viruskannasta 72 tunnin ajan. Inkuboinnin lopussa viljelmät pysäytetään brefeldiinillä, solut suspendoidaan uudelleen, värjätään fluorokromikonjugoiduilla anti-CD8- ja anti-interferoni-y (IFN-y) monoklonaalisilla vasta-aineilla (Becton&Dickinson) ja analysoidaan kuuden värin virtaussytometrillä. (FACSanto-Becton&Dickinson) ja FACS DIVA -ohjelmisto. Kuten jokaisessa solujakaumassa, tuman fluoresenssi puolittuu, lisääntyvät solut putoavat sytogrammin vasempaan kvadranttiin, mitä enemmän jakautumista, sitä vähemmän fluoresenssia. IFN-y:tä tuottavat solut putoavat sytogrammien ylempiin neljänneksiin. Solut, jotka spesifisellä influenssapeptidillä tai kontrolloivalla peptidistimulaatiolla sekä lisääntyvät että tuottavat aktiivisesti IFN-y:ta (Th1-sytokiinia), putoavat sytogrammin vasempaan yläkvadranttiin. Ne mitattiin frekvenssinä (proliferoituvat ja IFN-y:ta tuottavat solut / T-CD4+- tai CD8+-lymfosyytit yhteensä).

Hemagglutinaation estotesti Rokotteen immunogeenisyys testattiin hemagglutinaation estotestillä (HI).

Influenssaviruksella on kaksi tärkeää pintaglykoproteiinia: hemagglutiniini (HA) ja neuraminidaasi (NA). Influenssavirusten antigeeninen luokittelu ja alatyypit perustuvat näihin kahteen glykoproteiiniin. HA:lla on keskeinen rooli virussolujen sisäänpääsyssä sitoutumalla solun pintareseptoreihin, joita löytyy myös tiettyjen lajien punasoluista. Punasoluihin sitoutuminen johtaa hemagglutinaatioon, joka voidaan havaita agglutinoituneiden punasolujen mattona putken tai mikrotiitterikuopan pohjalla. HI-testissä viruksen hemagglutiniinia vastaan ​​suunnattu vasta-aine estää viruksen sitoutumisen verisoluihin ja estää siten hemagglutinaatioreaktion.

Immunisaatiota edeltävät ja sen jälkeiset HI-vasta-aineet testattiin Israelin terveysministeriön keskusvirologian laboratoriossa käyttämällä HI-testiä WHO:n standardimenettelyn 16 mukaisesti. Seerumit erotettiin, leimattiin koodilla ja säilytettiin -20 °C:ssa testaukseen asti. Seerumit käsiteltiin reseptoria tuhoavalla entsyymikolerasuodoksella epäspesifisten estäjien poistamiseksi ja kalkkunan punasoluilla epäspesifisten agglutiniinien poistamiseksi. Käsitellyt seerumit testattiin HI-testillä kolmea rokotteeseen sisältyvää antigeeniä vastaan: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) ja A/New Caledonia (NC). Kunkin antigeenin työlaimennos (testiannos) sisälsi neljä hemagglutiniiniyksikköä 25 ul:ssa antigeeniä. Testiannokset laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja lisättiin antiseerumin sarjalaimennukseen. Hemagglutiniinin estotiitteri määritettiin seerumin korkeimmaksi laimennokseksi, joka estää täysin punasolujen hemagglutinaation.

Antiseerumin tiitteri, joka ei osoittanut mitään estoa, kirjattiin <10. Humoraalinen vaste määriteltiin joko nelinkertaiseksi tai useammaksi tiitterin nousuksi tai nousuksi ei-suojaavasta lähtötasosta <1/40 arvoon 1/40 HI-vasta-aineissa neljä viikkoa rokotuksen jälkeen 17,18. Vasta-aineen geometriset keskimääräiset tiitterit laskettiin koko ryhmän immuniteetin arvioimiseksi.

Tutkimuksen ensisijainen päätepiste: gamma-interferonia tuottavien solujen osuus nivelreumapotilailla ja verrokkeilla Toissijainen päätepiste: rokotteen turvallisuus