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Respuesta de la inmunidad celular a la vacunación contra la influenza en pacientes con artritis reumatoide

26 de octubre de 2009 actualizado por: Tel-Aviv Sourasky Medical Center
La eficacia de la vacunación frente a la gripe en pacientes con artritis reumatoide se ha evaluado mediante la respuesta humoral. Sin embargo, la inmunidad celular es otra vía importante de respuesta a la vacunación. El propósito de este estudio es evaluar el grado de respuesta de la inmunidad celular a la vacunación antigripal. En este estudio participarán pacientes con artritis reumatoide y controles sanos, se les realizará una evaluación clínica el día de la vacunación y 4 semanas después. La respuesta de inmunidad humoral y celular se evaluará el día de la vacunación y 4 semanas después

Descripción general del estudio

Estado

Desconocido

Condiciones

Descripción detallada

Sesenta pacientes con AR y 30 controles sanos de la misma edad participarán en el estudio.

Después de firmar el consentimiento informado, todos los sujetos serán vacunados con la vacuna de virus fraccionados inactivados que recomendará la OMS el próximo otoño.

Los pacientes serán evaluados en el weel 0 y 6 semanas después. La evaluación clínica se basará en la Puntuación de actividad de la enfermedad 28 (DAS 28), que incluye el número de articulaciones hinchadas y sensibles, la evaluación global visual del médico, la VSG y la CRP. La sangre se recolectará el día de la vacunación y 6 semanas después.

Preparación de células mononucleares de sangre periférica Se obtendrán muestras de sangre antes y 4 semanas después de la vacunación. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislarán mediante centrifugación de sangre heparinizada en un gradiente de Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega). Las células se lavarán dos veces en medio de cultivo tisular RPMI (RPMI1640-Hepes con Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, EE. ) (GIBCO BRL, Nueva York, EE. UU.).

Ensayo ELISPOT Las placas de PVDF (difluoruro de polivinilideno, Millipore Corp., MA, EE. UU.) de 96 pocillos se humedecerán previamente con EtOH al 70 % y luego se recubrirán con 100 l/pocillo de anticuerpo monoclonal (mAb) anti-IFN humano 1-D1K, diluido a 15 g/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) filtrada estéril. Las placas se mantendrán durante la noche a 4°C. Se añadirá un total de 100 000 PBMC más 5 l/pocillo (1 g/ml) de péptidos a cada pocillo por duplicado para cada condición y se incubarán durante 24 h a 37 °C en CO2 al 5 %. Después de la incubación, las placas se lavaron con PBS y luego se añadieron a cada pocillo 100 l de mAb biotinilado (7-B6-1-biotina, Mabtech AB), diluido en PBS filtrado con FBS al 0,5 % a una concentración de 1 g/ml. Las placas se incubarán 2 h a temperatura ambiente, se lavarán con PBS y luego se incubarán con 100 l/pocillo de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Mabtech AB) diluida 1-1000 en PBS con FBS al 0,5 % durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, las células se desarrollarán añadiendo 100 l/pocillo de sustrato colorimétrico (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) y luego se contarán en un lector ELISPOT. Cada mancha fue producida por una única célula formadora de manchas de células T secretora de IFN (SFC). Todas las pruebas se realizaron por duplicado y se calcularon los valores medios. Se considerará que una respuesta es positiva cuando el número de manchas en los pocillos con células estimuladas con péptidos, después de restar el fondo (pocillos sin estimulación con péptidos), sea al menos dos veces mayor que el número de manchas de fondo14 y más que 20/106 SFC.

Detección de la producción de citocinas intracelulares mediante citometría de flujo El método de tinción intracelular se utilizará para identificar el fenotipo de las células T productoras de INF activadas por estimulación peptídica. La tinción se realizará utilizando el protocolo descrito por Rauser et al.15 Se estimularon PBMC durante 6 h con 1 g/ml de péptidos de influenza. Se añadirá Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) durante las últimas 4 h de incubación. Se obtendrá un control positivo estimulando las células con 0,5 g/ml de PMA (Phorbol 12-myrestate 13-acetate) y 1 g/ml de ionomicina (ambos de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.). Las células se permeabilizarán y teñirán con anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 o anti-CD8 y anti-IFN marcados con fluorocromo (Becton Dickinson, San José, CA, EE. UU.). Las muestras se analizarán mediante citometría de flujo utilizando FACSCalibur (Becton Dickinson). El límite positivo para esta prueba fue 0,05% de células T productoras de IFN.

La proliferación de CD4+ y CD8+ específicos La respuesta celular se evaluará analizando simultáneamente la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos tras la estimulación con antígenos de las tres cepas virales presentes en la vacuna y la producción de citocinas Th1 de activación por parte de las mismas células.

Brevemente, para analizar simultáneamente la proliferación y la producción de citocinas por parte de las células T específicas de la influenza, se obtendrán células mononucleares de sangre periférica en T0 y T1 de cada donante, se tiñerán con el colorante nuclear fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE; Molecular Probes) y se cultivarán por duplicado en la presencia de péptidos de HA de cada una de las cepas virales contenidas en la vacuna antigripal utilizada en el estudio o péptido control durante 72 h. Al final de la incubación, los cultivos se detendrán con brefeldin, las células se resuspenderán, se tiñerán con anticuerpos monoclonales anti-CD8 y anti-interferón-γ (IFN-γ) conjugados con fluorocromo (Becton & Dickinson) y se analizarán mediante un citómetro de flujo de seis colores. (FACSCanto-Becton&Dickinson) y software FACS DIVA. Como en cada división celular la fluorescencia nuclear se reduce a la mitad, las células en proliferación caen en los cuadrantes izquierdos del citograma, cuantas más divisiones, menos fluorescencia. Las células productoras de IFN-γ caen en los cuadrantes superiores de los citogramas. Las células que tras la estimulación específica del péptido de la gripe o del péptido de control proliferan y producen activamente IFN-γ (citocina Th1) se encuentran en el cuadrante superior izquierdo del citograma. Se midieron como frecuencia (células en proliferación y productoras de IFN-γ/linfocitos T CD4+ o CD8+ totales).

Prueba de inhibición de la hemaglutinación La inmunogenicidad de la vacuna se probó mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI).

El virus de la influenza tiene dos glicoproteínas de superficie importantes: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). La clasificación antigénica y la subtipificación de los virus de influenza se basan en estas dos glicoproteínas. HA desempeña un papel clave en la entrada de virus en las células al unirse a los receptores de la superficie celular, que también se encuentran en los glóbulos rojos de ciertas especies. La unión a los glóbulos rojos da como resultado la hemaglutinación, que puede observarse como una alfombra de glóbulos rojos aglutinados en el fondo de un tubo o pocillo de microtitulación. En la prueba HI, los anticuerpos dirigidos contra las hemaglutininas virales impiden que el virus se una a las células sanguíneas y, por lo tanto, inhibe la reacción de hemaglutinación.

Los anticuerpos HI antes y después de la inmunización se analizaron en el Laboratorio Central de Virología del Ministerio de Salud de Israel utilizando la prueba HI de acuerdo con un procedimiento estándar de la OMS 16. Los sueros se separaron, se etiquetaron con código y se almacenaron a -20 °C hasta que se analizaron. Los sueros se trataron con filtrado de cólera de enzima destructora de receptores para eliminar los inhibidores no específicos, y con glóbulos rojos de pavo para eliminar las aglutininas no específicas. Los sueros tratados se analizaron mediante la prueba HI frente a los tres antígenos incluidos en la vacuna: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) y A/Nueva Caledonia (NC). La dilución de trabajo (dosis de prueba) de cada antígeno contenía cuatro unidades de hemaglutinina en 25 µl de antígeno. Las dosis de prueba se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron a diluciones en serie de antisuero. El título de inhibición de la hemaglutinina se determinó como la dilución más alta de suero que inhibe completamente la hemaglutinación de los glóbulos rojos.

El título de un antisuero que no mostró ninguna inhibición se registró como <10. La respuesta humoral se definió como un aumento de cuatro veces o más en el título, o un aumento desde un nivel inicial no protector de <1/40 a 1/40 en anticuerpos HI cuatro semanas después de la vacunación 17,18. Se calcularon los títulos medios geométricos de anticuerpos para evaluar la inmunidad de todo el grupo.

Punto final primario del estudio: la proporción de células que producen interferón gamma en pacientes con artritis reumatoide y controles Punto final secundario: seguridad de la vacuna

Tipo de estudio

Intervencionista

Inscripción (Anticipado)

90

Fase

  • Fase 4

Contactos y Ubicaciones

Esta sección proporciona los datos de contacto de quienes realizan el estudio e información sobre dónde se lleva a cabo este estudio.

Estudio Contacto

Ubicaciones de estudio

      • Tel Aviv, Israel, 64239
        • Reclutamiento
        • Tel Aviv Medical Center
        • Contacto:
        • Sub-Investigador:
          • Dan Caspi, M.D

Criterios de participación

Los investigadores buscan personas que se ajusten a una determinada descripción, denominada criterio de elegibilidad. Algunos ejemplos de estos criterios son el estado de salud general de una persona o tratamientos previos.

Criterio de elegibilidad

Edades elegibles para estudiar

18 años a 90 años (Adulto, Adulto Mayor)

Acepta Voluntarios Saludables

No

Géneros elegibles para el estudio

Todos

Descripción

Criterios de inclusión:

  • Artritis reumatoide

Criterio de exclusión:

  • alergia al huevo

Plan de estudios

Esta sección proporciona detalles del plan de estudio, incluido cómo está diseñado el estudio y qué mide el estudio.

¿Cómo está diseñado el estudio?

Detalles de diseño

  • Propósito principal: Prevención
  • Asignación: No aleatorizado
  • Modelo Intervencionista: Asignación de un solo grupo
  • Enmascaramiento: Ninguno (etiqueta abierta)

¿Qué mide el estudio?

Medidas de resultado primarias

Medida de resultado
Periodo de tiempo
Respuesta de inmunidad celular
Periodo de tiempo: 4 semanas
4 semanas

Medidas de resultado secundarias

Medida de resultado
Periodo de tiempo
Seguridad de la vacunación antigripal
Periodo de tiempo: 4 semanas
4 semanas

Colaboradores e Investigadores

Aquí es donde encontrará personas y organizaciones involucradas en este estudio.

Publicaciones y enlaces útiles

La persona responsable de ingresar información sobre el estudio proporciona voluntariamente estas publicaciones. Estos pueden ser sobre cualquier cosa relacionada con el estudio.

Enlaces Útiles

Fechas de registro del estudio

Estas fechas rastrean el progreso del registro del estudio y los envíos de resultados resumidos a ClinicalTrials.gov. Los registros del estudio y los resultados informados son revisados ​​por la Biblioteca Nacional de Medicina (NLM) para asegurarse de que cumplan con los estándares de control de calidad específicos antes de publicarlos en el sitio web público.

Fechas importantes del estudio

Inicio del estudio

1 de octubre de 2009

Finalización primaria (Anticipado)

1 de marzo de 2010

Finalización del estudio (Anticipado)

1 de abril de 2010

Fechas de registro del estudio

Enviado por primera vez

15 de octubre de 2009

Primero enviado que cumplió con los criterios de control de calidad

26 de octubre de 2009

Publicado por primera vez (Estimar)

27 de octubre de 2009

Actualizaciones de registros de estudio

Última actualización publicada (Estimar)

27 de octubre de 2009

Última actualización enviada que cumplió con los criterios de control de calidad

26 de octubre de 2009

Última verificación

1 de octubre de 2009

Más información

Esta información se obtuvo directamente del sitio web clinicaltrials.gov sin cambios. Si tiene alguna solicitud para cambiar, eliminar o actualizar los detalles de su estudio, comuníquese con register@clinicaltrials.gov. Tan pronto como se implemente un cambio en clinicaltrials.gov, también se actualizará automáticamente en nuestro sitio web. .

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