Reakce buněčné imunity na očkování proti chřipce u pacientů s revmatoidní artritidou

Studie se zúčastní šedesát pacientů s RA a 30 zdravých, věkově odpovídajících kontrol.

Po podepsání informovaného souhlasu budou všechny subjekty očkovány inaktivovanou split virionovou vakcínou, kterou doporučí WHO příští podzim.

Pacienti budou hodnoceni v týdnu 0 a 6 týdnech později. Klinické hodnocení bude založeno na skóre aktivity onemocnění 28 (DAS 28), které zahrnuje počet oteklých a citlivých kloubů, vizuální celkové hodnocení lékařem, ESR a CRP Krev se odebírá v den vakcinace a o 6 týdnů později.

Příprava mononukleárních buněk periferní krve Vzorky krve budou odebrány před a 4 týdny po vakcinaci. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) budou izolovány centrifugací heparinizované krve na gradientu Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norsko). Buňky budou dvakrát promyty v tkáňovém kultivačním médiu RPMI (RPMI1640-Hepes s Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) a resuspendovány na koncentraci 2 106/ml v RPMI 1640 doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (FBS ) (GIBCO BRL, NY, USA).

Test ELISPOT 96jamkové PVDF (polyvinylidendifluorid, Millipore Corp., MA, USA) destičky budou předem navlhčeny 70% EtOH, poté potaženy 100 ul/jamku anti-lidské IFN-monoklonální protilátky (mAb) 1-D1K, zředěné na 15 g/ml ve sterilním filtrovaném fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Destičky se uchovávají přes noc při 4 °C. Celkem 100 000 PBMC plus 5 ul/jamku (1 g/ml) peptidů se přidá do každé jamky v duplikátech pro každou podmínku a inkubuje se po dobu 24 hodin při 37 °C v 5% CO2. Po inkubaci se destičky promyjí PBS, poté se do každé jamky přidá 100 ul biotinylované mAb (7-B6-1-biotin, Mabtech AB), zředěné ve filtrovaném PBS s 0,5% FBS na koncentraci 1 ug/ml. Destičky se inkubují 2 hodiny při teplotě místnosti, promyjí se PBS a poté se inkubují se 100 ul/jamku streptavidin-alkalické fosfatázy (Mabtech AB) zředěné 1-1000 v PBS s 0,5% FBS po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po promytí se buňky vyvinou přidáním 100 ul/jamku kolorimetrického substrátu (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) a poté se spočítají na čtečce ELISPOT. Každá skvrna byla produkována jednou IFN sekretující T-buňkou tvořící skvrnu (SFC). Všechny testy byly provedeny duplicitně a byly vypočteny průměrné hodnoty. Odpověď bude považována za pozitivní, když počet skvrn v jamkách s buňkami stimulovanými peptidem bude po odečtení pozadí (jamky bez peptidové stimulace) alespoň dvakrát větší než počet skvrn na pozadí14 a více než 20/106 SFC.

Detekce intracelulární produkce cytokinů průtokovou cytometrií Metoda intracelulárního barvení bude použita pro identifikaci fenotypu T buněk produkujících INF aktivovaných peptidovou stimulací. Barvení bude provedeno pomocí protokolu popsaného Rauserem et al.15 PBMC byly stimulovány po dobu 6 hodin 1 ug/ml chřipkových peptidů. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) bude přidán na poslední 4 hodiny inkubace. Pozitivní kontrola bude získána stimulací buněk 0,5 g/ml PMA (Phorbol 12-myrestate 13-acetát) a 1 g/ml ionomycinu (oba od Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Buňky budou permeabilizovány a obarveny fluorochromem značenými anti-CD3, anti-CD4 nebo anti-CD8 a anti-IFN- protilátkami (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Vzorky budou analyzovány průtokovou cytometrií pomocí FACSCalibur (Becton Dickinson). Pozitivní limit pro tento test byl 0,05 % T buněk produkujících IFN.

Proliferace specifických CD4+ a CD8+ Buněčná odpověď bude hodnocena simultánní analýzou proliferace specifických T CD4+ a CD8+ lymfocytů po stimulaci antigeny tří virových kmenů přítomných ve vakcíně a produkci aktivačních Th1 cytokinů stejnými buňkami.

Stručně řečeno, pro simultánní analýzu proliferace a produkce cytokinů T buňkami specifickými pro chřipku budou mononukleární buňky periferní krve získány v T0 a T1 od každého dárce, obarveny fluorescenčním jaderným barvivem karboxyfluorescein sukcinimidyl ester (CFSE; Molecular Probes) a kultivovány v duplikátech přítomnost peptidů HA z každého z virových kmenů obsažených ve vakcíně proti viru chřipky použité ve studii nebo kontrolním peptidu po dobu 72 hodin. Na konci inkubace budou kultury zastaveny brefeldinem, buňky resuspendovány, obarveny monoklonálními protilátkami anti-CD8 a anti-interferon-γ (IFN-γ) konjugovanými s fluorochromem (Becton&Dickinson) a analyzovány pomocí šestibarevného průtokového cytometru (FACSCanto-Becton&Dickinson) a software FACS DIVA . Jako při každém buněčném dělení je jaderná fluorescence poloviční, proliferující buňky spadají do levého kvadrantu cytogramu, čím více dělení, tím menší fluorescence. Buňky produkující IFN-y spadají do horních kvadrantů cytogramů. Buňky, které po stimulaci specifickým chřipkovým peptidem nebo kontrolním peptidem jak proliferují, tak aktivně produkují IFN-y (Th1 cytokin), spadají do levého horního kvadrantu cytogramu. Byly měřeny jako frekvence (proliferující a IFN-y produkující buňky/celkové T CD4+ nebo CD8+ lymfocyty).

Hemaglutinační inhibiční test Imunogenicita vakcíny byla testována hemaglutinačním inhibičním (HI) testem.

Virus chřipky má dva důležité povrchové glykoproteiny: hemaglutinin (HA) a neuraminidázu (NA). Antigenní klasifikace a subtypizace chřipkových virů je založena na těchto dvou glykoproteinech. HA hraje klíčovou roli při vstupu viru do buňky tím, že se váže na buněčné povrchové receptory, které se nacházejí také na červených krvinkách určitých druhů. Vazba na červené krvinky vede k hemaglutinaci, kterou lze pozorovat jako koberec aglutinovaných červených krvinek na dně zkumavky nebo mikrotitrační jamky. V HI testu protilátka namířená proti virovým hemaglutininům blokuje vazbu viru na krevní buňky a tím inhibuje hemaglutinační reakci.

Pre- a postimunizační HI protilátky byly testovány v Centrální virologické laboratoři izraelského ministerstva zdravotnictví pomocí HI testu podle standardního postupu WHO 16. Séra byla oddělena, označena kódem a skladována při -20 °C až do testování. Séra byla ošetřena cholerovým filtrátem enzymu ničícího receptory k odstranění nespecifických inhibitorů a tureckými červenými krvinkami k odstranění nespecifických aglutininů. Ošetřená séra byla testována HI testem proti třem antigenům obsaženým ve vakcíně: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) a A/New Caledonia (NC). Pracovní ředění (testovací dávka) každého antigenu obsahovalo čtyři jednotky hemaglutininu ve 25 ul antigenu. Testované dávky byly zředěny fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a přidány k sériovému ředění antiséra. Titr inhibice hemaglutininu byl stanoven jako nejvyšší ředění séra, které zcela inhibuje hemaglutinaci červených krvinek.

Titr antiséra nevykazujícího žádnou inhibici byl zaznamenán jako <10. Humorální odpověď byla definována jako buď čtyřnásobný nebo vícenásobný vzestup titru, nebo vzestup z nechráněné výchozí hladiny <1/40 až 1/40 u HI protilátek čtyři týdny po vakcinaci 17,18. Pro hodnocení imunity celé skupiny byly vypočteny geometrické průměrné titry protilátky.

Primární cíl studie: podíl buněk produkujících interferon gama u pacientů s revmatoidní artritidou a kontrol Sekundární cíl: Bezpečnost vakcíny